Caracterización termodinámica de los múltiples equilibrios químicos involucrados en la interacción entre la proteína NS3 helicasa del virus del dengue y oligonucelotidos de ARN...

• Autores: Cababie, Leila A.
• Año de publicación: 2019
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Gebhard, Leopoldo G.; González-Lebrero, Rodolfo M.; Kaufman, Sergio B.; Puntarulo, Susana; San Roman, Enrique; Castro, Guillermo
• Materia: NS3; Dengue; ARN; Helicasa; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Cababie, Leila A. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
La proteína NS3 del virus del dengue es una helicasa que cataliza la hidrólisis del nucleósidos trifosfato y acopla la energía libre de esta reacción a la locomoción sobre cadenas simples y el desplegado de cadenas dobles de ARN.\nEl presente trabajo se propone contribuir al objetivo general del laboratorio de dilucidar el\nmecanismo de funcionamiento de la proteína NS3 del virus del dengue en su rol de helicasa y desarrollar un modelo cinético detallado que permita explicar las propiedades funcionales de la NS3.\nPreviamente, en nuestro laboratorio se caracterizó la actividad NTPasa en estado estacionario\nde la NS3 y se estableció que, de acuerdo a los valores del parámetro kcat/KM, el orden de\nespecificidad de la enzima por los sustratos ensayados es ATP ? GTP ? CTP > UTP. En este\ntrabajo se evaluó el orden de especificidad por los cuatro nucleótidos cuando el sitio alostérico\nde la NS3 se encuentra ocupado por el ARN. Nuestros resultados indican que el orden de\nespecificidad por dichos nucleótidos es el mismo tanto en presencia como en ausencia de ARN.\nAsimismo, cuando se activa el sitio alostérico de unión al ácido nucleico la NS3 presenta una\nmarcada preferencia por los nucleótidos purínicos frente a los pirimidinicos. Para todos los\nsustratos ensayados, se observó un aumento de aproximadamente 9 veces en la constante cinética\nde recambio (kcat) y una disminución de aproximadamente 35 veces en la constante de Michaelis\n(KM) con respecto a los obtenidos en ausencia de ARN.\nUn segundo objetivo propuesto para este trabajo fue establecer el orden en que se liberan los\nproductos fosfato y ADP de la enzima durante el desarrollo del ciclo catalítico de hidrólisis de ATP por la NS3. Resolver este objetivo implicó deducir las ecuaciones de velocidad asociadas a distintos esquemas cinéticos para reacciones enzimáticas en las que se liberan dos productos.\nVerificar si todos los esquemas planteados son cinéticamente distinguibles entre sí y, por último,\nllevar a cabo la labor experimental acorde a la perspectiva que el desarrollo teórico imponga.\nNuestros resultados sugieren que luego del paso químico de la secuencia de reacciones de la\ncatálisis se libera el primer producto que es el fosfato y luego se libera el ADP, siguiendo un\norden estricto.\nCon el fin de caracterizar la interacción de la NS3 al ARN de cadena simple, realizamos\ntitulaciones fluorimétricas de la NS3 con ARN en condiciones de equilibrio empleando un\noligonucleótido de ARN marcado con un grupo fluoresceína. De este modo hallamos que la\nunión de la NS3 al ARN produce la liberación neta de entre 5 y 7 cationes monovalentes ó 3\ndivalentes desde el ARN como resultado de la neutralización efectiva de aproximadamente 10\ngrupos fosfato. Estas estimaciones no se ven afectadas por la presencia del dominio proteasa de\nla NS3, ni por la presencia del resto fluorescente unido al ARN. Los resultados indican que el efecto de las sales 1:1 es independiente de la naturaleza química de los cationes (K+, Na+ y Rb+)\ny que los efectos de Mg2+ y Ca2+ pueden describirse adecuadamente tomando en cuenta únicamente su interacción con el ácido nucleico, es decir, como ligandos que compiten respecto\nde los cationes monovalentes como así también de la proteína. Además, se presenta evidencia de\nque el pH ejerce solo un efecto negativo menor y monótono sobre la constante de unión\nobservada entre la proteína y el ácido nucleico, efecto que resulta ser más pronunciado para el\nARN marcado que para el sin marcar con el fluoróforo de fluoresceína. Se discute por qué esto\nsugiere que al menos un grupo titulable de la proteína está directamente involucrado en la\ninteracción con el ARN y que la unión de la NS3h favorece el estado desprotonado del resto\nfluoresceína en el ARN marcado. Por último, se estudió la dependencia de la constante de unión\nNS3-ARN con la temperatura y la variación de los parámetros termodinámicos ?rGº, ?rHº y ?rSº con la concentración de K+. El estudio permitió concluir que la unión de la proteína al ácido nucleico se encuentra impulsada entálpicamente pero todo el cambio en la energía libre de Gibbs\npor efecto de la concentración de sales procede exclusivamente de la variación en el término\nentrópico.\nFinalmente, nos propusimos caracterizar el efecto que ejercen los ligandos ADP y fosfato\nparticipantes del ciclo de hidrólisis de ATP sobre la interacción NS3-ARN. Estudiamos cómo\nvarían las propiedades de dicha interacción con el cambio del estado conformacional del sitio\ncatalítico de la NS3, es decir, el sitio de unión del ATP. Con este fin realizamos curvas de titulación por calorimetría isotérmica y observamos que la afinidad de la NS3 por el ARN disminuye tanto cuando el sitio catalítico está ocupado por el ADP como por el fosfato. No obstante el efecto que ejerce el ADP es mucho más pronunciado. Aunque el complejo formado\nentre la NS3 y el ARN se desestabiliza por la presencia de ambos ligandos en el sitio catalítico,\nel componente entálpico de la energía libre de Gibbs siempre favorece la estabilidad de dicho\ncomplejo.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Bioquímicas