Caracterización de una ARN Helicasa de Trypanosoma cruzi clonada por el método de Differential Display

• Autores: Díaz Añel, Alberto Marcelo
• Año de publicación: 1999
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Flawiá, Mirtha María
• Materia: ARN HELICASA; METACICLOGENESIS; DIFFERENTIAL DISPLAY; TRYPANOSOMA CRUZI; DIFERENCIACION; INFECTIVIDAD; GEN COPIA UNICA; ACTIVIDAD 3'-5'; RNA HELICASE; METACYCLOGENESIS; DIFFERENTIAL DISPLAY; TRYPANOSOMA CRUZI; DIFERENTIATION; INFECTIVITY; SINGLE COPY GENE; 3'-5' ACTIVITY
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Una de las últimas técnicas aplicadas en biología molecularpara detectar diferentes niveles de transcripción en distintosestadios de un mismo tipo celular es el Differential Display. Esteensayo se basa en la técnica de RT-PCR, utilizando un oligo dT “anclado” que se une al nacimiento del pon A+ de los ARNmensajeros, y un oligonucleótido corto de secuencia al azar que, endiferentes combinaciones, van a amplificar un set de bandascaracterístico para cada par de oligos elegidos. Estas reacciones secorren en un gel de poliacrilamida desnaturalizante y se observanpor autorradiografía. De esta forma se comparan ambos estadioscelulares y se recuperan del gel aquellas bandas que muestren unaamplificación diferencial como producto de distintos niveles de ARNmensajeros. Utilizando el Differential Display en los estadios no infectivo (epimastigotes) e infectivo (trypomastigotes metacíclicos) delparásito Trypanosomacruzi, causante de la enfermedad de Chagas,se purificaron varias bandas de expresión diferencial. Una de ellasaplicada como sonda en un Northern-blot demostró tener unatranscripción entre 8 y 9 veces mayor en trypomastigotesmetacíclicos. A partir de una biblioteca genómica realizada en elbacteriófago A Fix, se aisló un clon positivo para esta banda que,una vez secuenciado y comparado en bancos de datos, dió unahomología de hasta el 46 % a nivel de aminoácidos con diferentes ARN helicasas. Estas proteínas pertenecen a la familia de lasproteinas DEAD Box y participan en el relajamiento de estructurasde ARN doble cadena. Por lo tanto son importantes en procesoscomo transcripción, traducción, ensamblado de ribosomas, splicingy editing.Además se ha descripto su participación en diferenciacióny desarrollo celular, por lo cual se abre un campo muy importantecon en el estudio de la participación de estas proteinas en losprocesos de metaciclogénesis e infectividad del Trypanosoma cruzi. Por otro lado se demostró por Southern-blot que, a diferenciade la mayoría de los genes conocidos de Trypanosoma cruzi, el gende esta ARN helicasa es de única copia en el genoma. Ensayos de Cromo-blot con ia región que codifica al carboxilo terminal de laproteína mostraron que este gen se encuentra representado en porlo menos nueve cepas del parásito. Por último, se demostró queesta ARN helicasa posee una especificidad enzimática condirección 3’-5’ sobre transcriptos realizados in-vitro, con unaaparente independencia de ATP o GTP, como ocurre con algunosmiembros de esta familia El descubrimiento de este gen de transcripción diferencialentre ambos estadios de la metaciclogénesis de T. cruzi y lacaracterización parcial de su función enzimática, son el principiopara estudiar su participación en la diferenciación y/o infectividad deeste parásito y nos permitirá conocer un poco más de este procesodel cual se sabe tan poco y que es parte del comienzo de laenfermedad de Chagas en los huéspedes vertebrados, entre ellos elhombre.
One of the last techniques applied in molecular biology todetect different transcription levels in different stages of one cellulartype is the Differential Display. This assay is based on the techniqueof RT-PCR, using an oligo dT “anchored” that anneals to the birth ofthe messenger RNAs poly A, and a short oligonucleotide of atrandom sequence that, in different combinations, they will amplify acharacteristic set of bands for each couple of selected oligos. Thesereactions are run on a dennaturing polyacrylamide gel and they areobserved by autoradiography. This way both cellular stages arecompared and we can recover of the gel those bands that show adifferential amplification as product of different levels of messenger RNAs. Using the Differential Display in the stages non infective (epimastigotes) and infective (metaciclic trypomastigotes) of theparasite Trypanosoma cruzi, causing of the Chagas’ illness, wepurified several bands of differential expression. One of themapplied as probe in a Northern-blot demonstrated to have atranscription level between 8 and 9 times higher in metaciclictrypomastigotes. Starting from a genomic library carried out in A Fixbacteriophage, a positive clone was isolated for this band that, oncesequenced and compared in databases, showed an homology ofuntil 46% at level of aminoacids with different RNA helicases. These proteins belong to the family of the DEAD Box proteins andthey participate in the relaxing of RNA double chain structures. Therefore they are important in processes like transcription,translation, ribosome assembling, splicing and editing. Also it hasbeen described their participation in diferentiation and cellulardevelopment, reason why a very important field opens up with in thestudy of the participation of these proteins in the metaciclogénesisprocesses and infectivity of Trypanosoma cruzi. On the other hand it was demonstrated by Southern-blot that,contrary to most of the well-known genes of Trypanosoma cruzi, thegene of this RNA helicase is single copy in the genome. Assays of Chromo-blot with the region that codes to the carboxy terminal of theprotein, showed that this gene is represented in at least nine strainsof the parasite. Lastly, it was demonstrated that this RNA helicasepossesses an enzymatic specificity with 3’-5' direction withtranscripts carried out in-vitro, with an apparent independence of ATP or GTP, like it happens with some members of this family. The discovery of this gene of differential transcription betweenboth stages of the T. cruzi metacyclogenesis, and the partialcharacterization of their enzymatic function, is the principle to studytheir participation in the diferentiation and/or infectivity of thisparasite, and it will allow to us to know a little more about thisprocess of which is known so little and that it is part of the beginningof the Chagas’ illness in the vertebrate guests, among them theman.
Fil: Díaz Añel, Alberto Marcelo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.