Nueva generación de inmunoensayos basados en citometría de flujo para la detección simultánea de autoanticuerpos : aplicación al apoyo diagnóstico en diabetes mellitus autoinmune...

• Autores: Guerra, Luciano Lucas
• Año de publicación: 2017
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Iacono, Rubén F.; Valdez, Silvina N.; Cascone, Osvaldo; Costa Gil, José Esteban; Docena, Guillermo
• Materia: Inmunoensayos; Diabetes mellitus; Autoinmunidad; Diagnóstico; Ciencia de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Guerra, Luciano Lucas. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
En el área de DM autoinmune, es imprescindible el desarrollo de metodologías de menor costo y\ncomplejidad operativa respecto de los ensayos radiométricos de referencia, que permitan mayor\naplicación y difusión en laboratorios de mediana/baja complejidad y faciliten el acceso al diagnóstico\ncorrecto a un mayor número de pacientes, permitiendo implementar el tratamiento adecuado. En este\ncontexto, el objetivo general del presente trabajo fue el desarrollo y optimización de inmunoensayos\nbasados en Citometría de Flujo (FloCMIA) altamente sensibles y semicuantitativos para la determinación\nsimultánea y discriminativa de los principales marcadores de DM Autoinmune: GADA e IA-2A.\nEn la primera etapa se encaró el desarrollo de 3 protocolos alternativos de FloCMIA basados en\ndiferentes diseños para la determinación de autoanticuerpos anti-GAD (GADA) empleando microesferas\nde 4 ?m como fase sólida y diferentes reactivos conjugados a fluorocromos. Se evaluó su performance\nanalítica en pacientes con DM autoinmune provenientes del servicio analítico STAN-CONICET. En el\nprotocolo A se aplicó un modelo indirecto, mientras que en el protocolo B se ensayó la amplificación de\nla señal fluorescente asociada al modelo anterior por la incorporación del sistema de amplificación\navidina-biotina. Sin embargo, estos diseños no reunieron las condiciones adecuadas para aplicarse en la\nclínica rutinaria. El protocolo C se basó en el modelo de doble paratope, el cual es internacionalmente\naceptado para la detección de autoanticuerpos en DM autoinmune. De hecho, la mejor performance\nanalítica se logró con este modelo de FloCMIA y se expandió su aplicación a un grupo de muestras de\npacientes infanto-juveniles con DMT1. Este protocolo constituyó una alternativa innovadora, rentable y\nde menor complejidad operativa en comparación a la determinación tradicional de GADA por RBA y/o\ndpELISA en pacientes con DM autoinmune.\nEl desarrollo de los inmunoensayos para la detección de autoanticuerpos anti-IA-2 (IA-2A) requería de\nuna fuente del autoantígeno recombinante de fácil producción. Para ello, se aplicó el sistema de\nexpresión procariota en las cepas GI698 y GI724 de E. coli empleando la estrategia de síntesis acoplada a\nTrx. Este enfoque permitió obtener a la proteína TrxIA-2ic a partir de la FSI de la cepa GI724 con alto\nrendimiento, correctamente plegada y con alta estabilidad durante su almacenamiento. TrxIA-2ic\ndemostró un excelente comportamiento inmunoquímico validado por diversos estudios de unión a\nIA-2A.\nA partir de los resultados obtenidos se procedió a la optimización de ensayos no radiométricos en fase\nsólida para la determinación de IA-2A en pacientes con DMT1. Entre los modelos ensayados, el bcELISA,\nbasado en un modelo indirecto para la detección de anticuerpos con revelado colorimétrico, no\npresentó una performance adecuada para poder aplicarse en el laboratorio de apoyo diagnóstico\ndiabetológico. Sin embargo, QL-dpELISA y el protocolo C de FloCMIA aplicado a la determinación de\nIA-2A, basados en el modelo de doble paratope con variaciones en la fase sólida empleada (microplaca o microesferas de 5 ?m) y el sistema de detección del inmunocomplejo (quimioluminiscencia o\nfluorescencia), presentaron parámetros analíticos mejorados permitiendo considerarlos como métodos\nalternativos candidatos para reemplazar al RBA.\nContando con los 2 autoantígenos recombinantes principales vinculados a DMT1 (TrxGAD y TrxIA-2ic),\nexpresados en forma recombinante en E. coli en gran cantidad y correctamente plegados, se pudieron\ndesarrollar el diseño de FloCMIA multiplex (de menor costo y complejidad operativa respecto de los\nmétodos radiométricos de referencia) empleando la discriminación por tamaño de microesferas, para la\ndeterminación simultánea y discriminativa de GADA e IA-2A en pacientes con DMT1. El FloCMIA\nmultiplex no sólo presentó una excelente performance analítica, sino que evidenció un mayor número\nde pacientes con autoinmunidad que cuando se ejecutó cada RBA por separado. Asimismo, constituyó\nuna alternativa menos costosa y compleja y se evitó el uso de material radiactivo.\nLos resultados obtenidos demostraron que FloCMIA multiplex es una buena alternativa para aplicar\ntanto en programas de predicción y prevención de la DMT1, como en el apoyo diagnóstico de\nautoinmunidad de distintas formas clínicas de DM, permitiendo instaurar el tratamiento adecuado en\nlos pacientes. Asimismo, la metodología desarrollada de menor complejidad operativa respecto al RBA\nestimula la descentralización de las determinaciones, ampliando el acceso al diagnóstico a un número\nmayor de pacientes.
Ciencias Bioquímicas
Doctor de la Universidad de Buenos Aires en Farmacia y Bioquímica