Estudio molecular y funcional del gen cassette aadA1

• Autores: Galán Delgado, Angélica
• Año de publicación: 2018
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de maestría
• Colaborador/a o director/a de tesis: Quiroga, María Paula; Centrón, Daniela; Mollerach, Marta; Power, Pablo; Pettinari, Julia
• Materia: Transferencia horizontal genética; THG; ATTC; Genes cassette; Genes de resistencia antibiótica; Bioinformática; Peces oséos; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Genetic horizontal transfer (GHT) is one of the most efficient evolutionary strategies of bacteria. Acquisition of foreign genetic material allows to increase the genetic variability of a specific genome, almost instantaneously. Integrons are genetic elements, keys in the capture, expression and dispersion of genes in form of cassette among gram-negative bacteria. Integrons encode a specific site recombinase, integrase (IntI), which recognizes two different recombination sites, the attI site, adjacent to the intI gene, and the attC sites. Cassettes are the mobile elements of this genetic platform, and are designed by an open reading frame (ORF) and an attC site, the architecture of the typical cassettes inserted in the variable region of the integron are atti1-ORF- attC and attC-ORF-attC. Class 1 and 2 integrons are the most successful in hospital environment, while others have been detected sporadically.\nMost of the antibiotic resistance genes that are found in the clinic currently originated from environmental bacteria, including antibiotic-producing species. Two branches of aadA cassette genes have been described that confer resistance to streptomycin/ spectinomycin associated with integrons in clinical strains. These branches are aadA1 and aadA2. Both are study models, since it has been described that at least the aadA1 cassette gene would have been present prior to the antibiotic era and would have been transmitted through HGT events to the current clinical bacteria. This cassette gene is widely distributed in clinical isolates contributing to the problem of antibiotic multiresistance, which is why we conducted a molecular and functional study of it in this work.\nThrough bioinformatic analysis we identified a group of 37 alleles that we entitled aadA-like. We found that only the aadA1 cassette gene is associated with class 1 and 2 integrases, unlike the remaining aadA-like alleles, which are exclusively associated with class 1 integrase; aadA1 allele is the most abundant and also the one with more arrangements in the variable zone of the integron in which it is contained. In second and third place, are the alleles aadA2 and aadA5 respectively. In the matter of associated cassette genes, we found that aadA1 cassette gene is closely related to dfrA1 cassette gene or is exclusive in the variable zone in type 1 integrons. Additionally, this cassette gene have a tendency to be located in the 3 first positions of the variable zone of the integron, which explains its high resistance expression in clinical isolates.\nRegarding the analysis of dispersion of aadA1 cassette gene, through the study of the dispersion of its attC site, we found a total of 86 associated cassette gene arrays, keeping association with the cassette gene dfrA1 or aadA1 cassette gene as exclusive in variable zone. The association of the aadA1 cassette gene to integrases of class 1 integrons was 84%. aadA1 cassette gene is closely related to dfrA1 cassette gene. Their association is maintained both in class 1 and class 2 integrons.\nConcerning to the study of genetic components of the group aadA-like gene cassettes through analysis of alignment and maximum similarity, the formation of some groups was observed, emphasizing the group that includes what we call aadA1-like alleles (7 alleles).\nUsing CLUSTALW and maximum similarity analysis, 15 variants of the attC site were identified, associated with 37 aadA-like alleles with a greater sequence identity between the nucleotide bases involved in the recombination, specifically in 1L and 1R regions (RYYYAAC and GTTRRRY, respectively). Variant 1 contains most of the alleles: 15. As in the case of the analysis of the ORFs, the grouping of most of the alleles corresponds to the so-called aadA1-like alleles, which confirms the high dispersion of this gene cassette in particular.\nIn functional study of aadA1 cassette gene, we analyzed the molecular characteristics of the attC flanking sites of this cassette gene in the bacterial clones in which we carried out recombination tests. The structure of cloned cassette genes in each of these plasmids corresponds to typical structures observed in different clinic integrons arrays: attCaadA1, attCaadA3, attCaacA1 y attCdfrA1. We analyze the regions involved in the recombination process: the core site or 1R region, the 1L region or inverse core site and the presence and spacing of extrahelical bases.\nWe found that the attCaadA1 site is the only one that fit in completely to consensus sequence of the 1R region or core site 5'-GTTRRRY-3 '. The three remaining attC sites (attCaadA3, attCaacA1 and attCdfrA1) are characterized by having a transversion of a Purine to Pirimidine in one of its nucleotides, but not in those nucleotides where the integrase performs the cut in the recombination process 5'-G ' TT-3 '(The cut-off point is between G and T). The sites attCaadA1 and attCaadA3 have 100% sequence identity between their 1L 5'-GTTTAAC-3' regions and coincide exactly with the consensus sequence of the 1L region,\nwhile those corresponding to the attCaacA1 and attCdfrA1 sites present the transversion of one nucleotide each.\nThe extrahelical bases of the attC sites studied: attCaadA1, attCaadA3, attCaacA1 correspond to Guanine and Thymine except for that observed in the attCdfrA1 site which has as extrahelical bases a cytosine and an adenine. The most evident and significant difference with respect to the extrahelical bases within the attC sites analyzed is the spacing between them, and in those attC sites that share the same extrahelicoidal bases and the same nucleotide distance between them: attCaadA1, attCaadA3, attCaacA1, the most significant differences correspond to the length of the attC site, which apparently would have no influence on recombination frequencies, at least for the attC sites that we analyzed in this work.\nNoticing the determinants of structural recognition of importance for recombination, we can say that the attCaadA1 and attCaadA3 sites maintain an identity regarding their extrahelical bases G and T, as well as the distance between them (6 base pairs), which could be contributing to increase the scission frequencies through recombination. Regarding to attCaacA1 site, the extrahelicoidal bases retain the same G and T identity and the same spacing between them (6 base pairs) and present very similar scission values when this attC site is in the attCaacA1-aadA1-attCaadA1 structure.\nTwo attC recombination sites, the attCaadA3 site of 60 bp and the attCaacA1 site of 118 bp, that are different in length and in their spacer region have very similar recombination frequencies, which indicates that importance of identity of the extrahelical bases and the spacing between them is the fundamental characteristic that influences the frequency of recombination, while the attCdfrA1 site whose extrahelical bases are C and A with a distance between them of 7 to 8 bp presents a marked decrease in the excision frequencies.\nAs regards recombination assays carried out in vivo for the excision of cassette genes, mediated by IntI1, using in each case the clone PMI1-1 (AS) 2 (intI1-attI1) containing the gene of integrase type 1 co-transforming E. coli TOP10 with each of the following clones: pLQ423 (attI1-aadA1-attCaadA1), pLQ443 (attCaadA3-aadA1-attCaadA1), pLQ445 (attCaacA1-aadA1-attCaadA1) or pLQ426 (attCdhfr1-aadA1-attCaadA1). It was observed that the first three structures are favorable targets for IntI1-mediated excision, unlike the cassette gene attCdhfr1-aadA1-attCaadA1 where the excision frequency value was the lowest of all the assays. Regarding the insertion frequencies at the attI1 site, analyzing the net insertion, it was observed that recombination was favored between the attI1 site and the attCaadA3 and attCaacA1 sites through the cointegrated pathway.\nAnalyzing bioinformatics and functional results together we observed that the molecular patterns that favor the excision and net insertion of cassettes differ from each other and therefore must continue to be studied in a particular way to achieve a possible consensus of parameters that brings together all the requirements of the target sites of the integron integrase of class 1.
Fil: Galán Delgado, Angélica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
La Transferencia Horizontal Genética (THG) es una de las estrategias evolutivas más eficientes de las bacterias, ya que la adquisición de material genético foráneo permite aumentar la variabilidad genética de un determinado genoma, de manera casi instantánea. Los integrones son elementos genéticos, claves en la captura, expresión y dispersión de genes que se encuentran bajo forma de genes cassettes entre las bacterias gram-negativas. Codifican una recombinasa sitio específica, la integrasa (IntI), la cual reconoce dos sitios de recombinación muy diferentes entre sí, el sitio attI, adyacente al gen intI, y los sitios attC. A su vez, los genes cassettes son los elementos móviles de esta plataforma genética, y están formados por un marco de lectura abierto (ORF) y un sitio attC, siendo la arquitectura de los genes cassettes típicos insertos en la región variable del integrón attI1-ORF-attC y attC-ORF-attC. Los integrones de clase 1 y 2 son los más exitosos dentro del ambiente hospitalario, asociados a multirresistencia antibiótica mientras que otros han sido detectados esporádicamente.\nLa mayoría de los genes de resistencia antibiótica que se encuentran en la clínica actualmente se originaron a partir de bacterias del ambiente, incluyendo especies productoras de antibióticos. Se han descrito dos ramas de genes cassettes aadA que confieren resistencia a estreptomicina/espectinomicina asociados a integrones en cepas clínicas. Estas ramas son aadA1 y aadA2. Ambas son modelo de estudio, ya que se ha descrito que al menos el gen cassette aadA1 habría estado presente previo a la era antibiótica y se habría transmitido a través de eventos de THG a las bacterias clínicas actuales. Dicho gen cassette se encuentra ampliamente distribuido en los aislamientos clínicos aportando a la problemática de la multiresistencia antibiótica, razón por la cual realizamos un estudio molecular y funcional del mismo en este trabajo.\nA través de análisis bioinformáticos identificamos un grupo de 37 alelos que denominamos aadA-like. Encontramos que únicamente el gen cassette aadA1 está asociado a integrones de clase 1 y 2, a diferencia de los alelos aadA-like restantes, que están asociados exclusivamente a los de clase 1. El alelo aadA1 es el más abundante y asimismo es el que más arreglos presenta en la zona variable del integrón en el cual está contenido. En segundo y tercer lugar de prevalencia, están los alelos aadA2 y aadA5 respectivamente. Con respecto a los genes cassettes asociados, encontramos que el gen cassette aadA1 está estrechamente relacionado con el gen cassette dfrA1 o se encuentra solo en la zona variable en integrones de tipo 1. Adicionalmente, este gen cassette se tiende a ubicar en las 3 primeras posiciones de la zona variable del integrón, lo que explica la alta expresión de la resistencia en aislamientos clínicos.\nEn cuanto al análisis de la dispersión del gen cassette aadA1, lo encontramos un total de 86 arreglos de genes cassettes,. La asociación del gen cassette aadA1 a integrasas de integrones de clase 1 fue del 84% Los genes cassettes aadA1 y dfrA1 se encontraron juntos tanto en integrones de clase 1 como de clase 2, lo que nos da una idea de que estos dos genes cassettes están muy asociados en los integrones clínicos.\nCon respecto al estudio de los componentes genéticos de los genes cassettes aadA-like a través de análisis de alineamiento y máxima similitud, se observó la formación de algunos grupos, destacando el grupo que incluye a los que denominamos como alelos aadA1-like (7 alelos).\nMediante los análisis utilizando CLUSTALW y máxima similitud se identificaron 15 variantes del sitio attC asociadas a los 37 alelos aadA-like con una mayor identidad de secuencias entre las bases nucleotídicas involucradas en la recombinación específicamente en las regiones 1L y 1R (RYYYAAC y GTTRRRY, respectivamente). La variante 1 del sitio attC proveniente del agrupamiento de máxima similitud contiene a casi la mitad de los alelos (15 de 37). Al igual que para el caso del análisis de los ORFs, la agrupación de la mayoría de los alelos corresponde a los denominados alelos aadA1-like lo cual confirma la alta dispersión de este gen cassette en particular.\nPara el estudio funcional del gen cassette aadA1 analizamos las características moleculares de los sitios attC flanqueantes de este gen cassette en los clones en los cuales realizamos ensayos de recombinación. La estructura de los genes cassettes clonados en cada uno de estos plásmidos corresponde a estructuras típicas observadas en diferentes arreglos de integrones de la clínica: attCaadA1, attCaadA3, attCaacA1 y attCdfrA1. Analizamos las regiones que están involucradas en el proceso de recombinación, la región core site o 1R, la región 1L o inverse core site y la presencia y espaciado de bases extrahelicoidales.\nEncontramos que el sitio attCaadA1 es el único que se ajusta completamente a la secuencia consenso de la región 1R o core site 5?-GTTRRRY-3?. Los tres sitios attC restantes (attCaadA3, attCaacA1 y attCdfrA1) se caracterizan por tener una transversión de una Purina a Pirimidina en uno de sus nucleótidos, pero no en aquellos nucleótidos donde la integrasa realiza el corte en el proceso de recombinación 5?-G?TT-3? (El punto de corte es entre la G y la T). Los sitios attCaadA1 y attCaadA3 tienen un 100% de identidad de secuencia entre sus regiones 1L 5?-GTTTAAC-3? y coinciden exactamente con la secuencia consenso de la\nregión 1L, mientras que los correspondientes a los sitios attCaacA1 y attCdfrA1 presentan la transversión de un nucleótido cada uno.\nAl observar los determinantes de reconocimiento estructural de importancia para la recombinación, se pudo determinar que los sitios attCaadA1 y attCaadA3 mantienen una identidad en cuanto a sus bases extrahelicoidales G y T, así como la distancia entre ellas (6 pares de bases), lo cual podría estar contribuyendo a aumentar las frecuencias de escisión durante la recombinación. Con respecto al sitio attCaacA1 las bases extrahelicoidales conservan la misma identidad G y T y el mismo espaciado entre ellas (6 pares de bases) y presentan valores muy similares de escisión cuando este sitio attC está en la estructura attCaacA1-aadA1-attCaadA1.\nDos sitios de recombinación attC, el sitio attCaadA3 de 60 pb y el sitio attCaacA1 de 118 pb, muy diferentes en longitud y en su región espaciadora, presentan frecuencias de recombinación muy parecidas, lo cual indica que la importancia de la identidad de las bases extrahelicoidales y el espaciado entre las mismas, es la característica fundamental que influye sobre la frecuencia de recombinación mientras que el sitio attCdfrA1 cuyas bases extrahelicoidales son C y A con una distancia entre ellas de 7 a 8 pb presenta un marcado descenso en las frecuencias de escisión.\nEn cuanto a los ensayos de recombinación de genes cassettes mediados por IntI1 realizados in vivo, se utilizaron en cada caso al clon PMI1-1 (AS)2 (intI1-attI1) que contiene al gen de la integrasa de los integrones de clase 1 cotransformando E. coli TOP10 con de los siguientes clones: pLQ423 (attI1-aadA1-attCaadA1), pLQ443 (attCaadA3-aadA1-attCaadA1), pLQ445 (attCaacA1-aadA1-attCaadA1) o pLQ426 (attCdhfr1-aadA1-attCaadA1). Se observó que las tres primeras estructuras son blancos favorables para la escisión mediada por IntI1, a diferencia del gen cassette attCdhfr1-aadA1-attCaadA1 donde el valor de frecuencia de escisión fue el más bajo de todos los ensayos. Con respecto a las frecuencias de inserción en el sitio attI1, al analizar la inserción neta, se observó que se favoreció la recombinación entre el sitio attI1 y los sitios attCaadA3 y attCaacA1 a través de la vía de cointegrados.\nAl analizar en conjunto los resultados de bioinformática y funcionales observamos que los patrones moleculares que favorecen a la escisión e inserción neta de cassettes difieren entre sí y por lo tanto deben seguir siendo estudiados en forma particular para lograr un posible consenso de parámetros que reúna todos los requerimientos de los sitios blanco de la integrasa de integrones de clase 1.
Magíster de la Universidad de Buenos Aires en Biología Molecular Médica