Rol de las isoenzimas del Citocromo P450 en el desencadenamiento y la severidad de la Porfiria Cutánea Tardía

• Autores: Gordillo, Diego Miguel
• Año de publicación: 2020
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Parera, Victoria Estela; Buzaleh, Ana María; Álvarez, Silvia; Rossetti, María Victoria; Galleano, Mónica; Cánepa, Eduardo; Larripa, Irene
• Materia: Citocromo P450; Porfiria cutánea tardía; PCT; CYP-450; URO-D; SNP; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Porphyrias are metabolic disorders caused by deficiency in one of the enzymes of heme biosynthesis. Porphyria Cutanea tarda (PCT), the most common of all Porphyrias, results from a decrease in the activity of uroporphyrinogen decarboxylase (URO-D) at the liver level (A-PCT) or in all organs (H-PCT). A-PCT is the most common (75 to 80%) of this type of Porphyria, H-PCT has autosomal dominant inheritance and URO-D has an activity of about 50% than normal value. When its character is homozygous or heterozygous compound is called Hepatoerythropoietic Porphyria (HEP). PCT is a low-penetrance disease, appears in adulthood at approximately 40 years and the ratio male:woman is 4:1. There are various agents that are able to trigger it such as alcohol, estrogen, iron overload, polyhalogenated hydrocarbons, nitrosamines from tobacco smoke and hepatotropic viruses.\nOur hypothesis is based on the assumption that the presence of SNPs in CYPs would play a role in the triggering of Porphyria by increasing the metabolizing capacity of CYPs by generating metabolites that would inhibit URO-D. The overall objective was to provide additional evidence on the possibilities of PCT manifestation and to expand our knowledge of the CYP system's involvement in the clinical expression of PCT.\nTo get our objective, the following variants were genotyped: CYP1A1 (*4 or m4, *2C or m2, *2A or m1), CYP1A2 (*1F) and CYP2E1 (*5B and *7B), which were selected based on previous report about their relationship with the development of cancer but with respect to Porphyria the results are conflictive. In this context we decided to study its genotype and allele frequencies and its relationship with this disease in the Argentine population. The following population was studied: 36 H-PCT patients, 76 A-PCT and 89 controls. In all cases the individuals signed the informed consent and the project was approved by the CIPYP Ethics Committee. The RFLP-PCR technique was used, sequencing was used when the pattern of bands obtained was not clear.\nGenotype and allele frequencies were estimated by direct count for each SNP. Risk genotypes and alleles were calculated by bioinformatics methods through VCCStats using the parameters: Odd Ratio, confidence intervals and Fisher p; results were reported only when the differences were statistically significant (pf<0.05). For the study of risk haplotypes, 64 samples from the 112 studied were used: 24 Controls, 23 H-PCT and 17 A-PCT, using the SNPStats program. With the SNP predict program the effect of the amino acid change on the structure of the enzyme and its role in triggering the PCT was estimated.\nCYP1A2*1F (C/A) is an atypical case in which the reference allele is the least common, the same trend was observed in our population. The genotype containing A allele, was a risk factor to trigger the PCT.\nFor our population the CYP1A1*4 (C/A) variant showed that the frequency of the alternative homozygous genotype was significantly higher in H-PCT than in controls; this genotype was non-existent in A-PCT. The frequency of A allele was higher in hereditary than in acquired. For groups: H-PCT vs Control and A-PCT the A/A genotype and A allele result to be of risk. The effect of this alternative variant is not clearly reported but it would be a risk factor for H-PCT in our population.\nIn the case of CYP1A1*2C (A/G) for genotype frequency the profiles were different from those expected. Alternative homozygous usually occurs in low proportion or is non-existent. The genotype containing the G allele in heterozygous turned out to be risky for H-PCT vs A-PCT.\nFor CYP1A1*2A (T/C) in H-PCT vs A-PCT the T/T genotype was found in the higher proportion in this first group and for T/C the frequency was higher in the latter. Our results do not show significant risk association by contrasting porphyric with controls and hereditary with acquired ones.\nThe study of risk haplotypes yielded significant differences for H-PCT vs Control being in this order m4-m2-m1-1A2: C-G-C-C.\nIn CYP2E1*5B (C/T) allele C was the most common, reference homozygous frequencies were like to those of heterozygous, no alternative homozygous was found. There were no significant differences in any of the contrasted groups for each genotype and allele. No association between the alternative variable and the PCT was found in our population.\nFor CYP2E1*7B (G/T) the ancestral allele was the most frequent and each variant has a similar frequency for different groups. The T allele in homozygous is at a low frequency. In our results for H-PCT vs A-PCT G/T vs G/G gave significant risk association.\nThe CYP2E1 risk haplotype study found that T-T was the risk haplotype for all groups of PCTs contrasted with controls.
Fil: Gordillo, Diego Miguel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
Las Porfirias son desórdenes metabólicos producidos por deficiencia en una de las enzimas de la biosíntesis del hemo. La Porfiria Cutánea Tardía (PCT), la más frecuente de todas las Porfirias, es consecuencia de una disminución en la actividad de la uroporfirinógeno decarboxilasa (URO-D) a nivel hepático (PCT-A) o en todos los órganos (PCT-H). La PCT-A es la más común (75 a 80%) de este tipo de Porfiria, la PCT-H es de herencia autosómica dominante y la URO-D tiene un valor de alrededor del 50% de actividad con respecto al valor normal. Cuando su carácter es homocigota o heterocigota compuesto se la conoce como Porfiria Hepato Eritropoyética (PHE). La PCT es una enfermedad de baja penetrancia, aparece en la adultez aproximadamente a los 40 años y la relación Hombre:Mujer es de 4:1. Hay diversos agentes que son capaces de desencadenarla como ser el alcohol, estrógenos, acumulación de hierro, hidrocarburos polihalogenados, nitrosaminas del humo del tabaco y virus hepatotrópicos.\nNuestra hipótesis se basa en que la presencia de SNPs en los citocromos P450 (CYPs) jugaría un rol en el desencadenamiento de la Porfiria, aumentando la capacidad metabolizadora de los CYPs y generando metabolitos que inhibirían a la URO-D. El objetivo general fue aportar evidencias adicionales sobre las posibilidades de manifestación de la PCT y ampliar nuestro conocimiento sobre la participación del sistema CYP en la expresión clínica de esta enfermedad.\nPara cumplir nuestro objetivo se genotipificaron las variantes: CYP1A1 (*4 ó m4, *2C ó m2, *2A ó m1), CYP1A2 (*1F) y CYP2E1 (*5B y *7B), las cuales se seleccionaron en base a trabajos previos donde se reporta su relación con el desarrollo del cáncer, pero con respecto a la Porfiria los resultados son discordantes. En este contexto decidimos estudiar las frecuencias genotípicas y alélicas y su relación con esta enfermedad en la población Argentina. Se estudió la siguiente población: 36 pacientes PCT-H, 76 PCT-A y 89 controles. En todos los casos los individuos firmaron el consentimiento informado y se contó con la aprobación del Comité de Ética. Se utilizó la técnica de PCR-RFLP seguida por secuenciación cuando el patrón de bandas obtenidas no fue claro.\nSe estimaron las frecuencias genotípicas y alélicas por conteo directo para cada SNP. Los genotipos y alelos de riesgo se calcularon por métodos bioinformáticos a través del VCCStats usando los parámetros: Odd Ratio, intervalos de confianza y p de Fisher; sólo se informaron los resultados cuando las diferencias fueron estadísticamente significativas (pf<0,05). Para el estudio de haplotipos de riesgo se utilizaron 64 muestras de las 112 estudiadas: 24 Controles, 23 PCT-H y 17 PCT-A, utilizando el programa SNPStats. Con el programa SNP predict fue estimado el efecto del cambio de aminoácido en la estructura de la enzima y su rol en el desencadenamiento de la PCT.\nEl CYP1A2*1F (C/A) es un caso atípico en el cual el alelo de referencia es el menos frecuente, la misma tendencia se observó en nuestra población. El genotipo que contiene el alelo A o el alelo A per se fue de riesgo para desencadenarla PCT.\nLos resultados para la variante CYP1A1*4 (C/A) en nuestra población arrojaron que la frecuencia del genotipo homocigota alternativo fue significativamente mayor en PCT-H que en controles; este genotipo fue inexistente en PCT-A. En la alélica la frecuencia de A fue mayor en hereditarios que en adquiridos. Para los grupos: PCT-H vs Control y PCT-A el genotipo A/A y el alelo A resultó ser de riesgo. Si bien no está claramente reportado el efecto de esta variante alternativa la misma sería un factor de riesgo para PCT-H.\nEn el caso del CYP1A1*2C(A/G) en cuanto a las frecuencias genotípicas los perfiles fueron diferentes a los esperados En ambos casos el homocigota alternativo suele presentarse en baja proporción o ser inexistente. El genotipo que contiene el alelo G en heterocigosis resultó ser de riesgo para PCT-H vs PCT-A.\nPara el CYP1A1*2A(T/C), en PCT-H vs PCT-A el genotipo T/T se halló en mayor proporción en este primer grupo y para T/C la frecuencia fue mayor en este último. Nuestros resultados no arrojan asociación de riesgo significativa al contrastar porfíricos con controles y hereditarios con adquiridos. El estudio de haplotipos de riesgo arrojó diferencias significativas para PCT-H vs Control siendo en este orden m4-m2-m1-1A2:C-G-C-C.\nEn el CYP2E1*5B (C/T) el alelo C fue el más frecuente, las frecuencias del homocigota de referencia fueron similares a las del heterocigota, no se encontró el homocigota alternativo. No hubo diferencias significativas en ninguno de los grupos contrastados para cada genotipo y alelo. En nuestra población no se halló ninguna asociación entre la variable alternativa y la PCT.\nPara el CYP2E1*7B (G/T) el alelo ancestral fue el de mayor frecuencia y cada variante tiene una frecuencia similar para los diferentes grupos. El alelo T en homocigosis está en una baja frecuencia. En nuestros resultados para PCT-H vs PCT-AG/T vs G/G dio asociación significativa de riesgo.\nEn el estudio de haplotipos de riesgo para el CYP2E1 se observó que T-T era el haplotipo de riesgo para todos los grupos de PCTs contrastados con controles.
Ciencias Bioquímicas
Doctor de la Universidad de Buenos Aires en Farmacia y Bioquímica