Modificaciones postraduccionales redox de proteínas como mecanismo de integración de las señales en respuesta al estrés abiótico: impacto sobre el crecimiento en plantas

• Autores: Méndez, Andrea Analía Elena
• Año de publicación: 2019
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Pena, Liliana Beatriz; Gallego, Susana Mabel; Malanga, Gabriela; Iusem, Norberto; Civello, Pedro
• Materia: Estrés abiótico; Zea mays (L); Kinasa dependiente de ciclina A; Arabidopsis thaliana; Metionina sulfóxido reductasas; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Méndez, Andrea Analía Elena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
El estrés abiótico produce en plantas reducción del crecimiento y desequilibrio redox celular. En esa condición, el proteoma está directamente sujeto a la acción de las especies activas del oxígeno y del nitrógeno, transformando a las proteínas en blancos de modificaciones postraduccionales (MPTs) redox. Dentro de las mismas se encuentran las de carácter irreversible, como la carbonilación, y aquellas que pueden ser revertidas por la acción de enzimas, como la oxidación de la metionina (Met) por la familia de las metionina sulfóxido reductasas (MSR). La bioquímica del ciclo celular incluye la actividad del complejo formado entre la kinasa dependiente de ciclina A (CDKA) y sus unidades regulatorias positivas -las ciclinas tipo D (CycD)- responsable de la transición G1/S en eucariotas. Esta actividad se encuentra modulada por una red compleja de interacción con otras proteínas y por MPTs, entre ellas la fosforilación y la ubiquitinación. La comprensión del impacto del estrés abiótico y el estrés oxidativo sobre la regulación del ciclo celular es limitada. Evidencia indirecta indica que el incremento de los niveles de carbonilación de las CDKA y CycD durante el estrés abiótico se podría correlacionar con una disminución del crecimiento de la raíz. Sobre esta base el objetivo general del presente trabajo fue establecer el rol que desempeñan las MPTs redox de proteínas relacionadas con el ciclo celular en plantas sometidas a condiciones ambientales desfavorables.\nInicialmente se determinó en ejes embrionarios de Zea mays L. (maíz) una disminución del crecimiento y una pérdida de la homeostasis redox producidos por cadmio (reconocido metal capaz de generar estrés oxidativo), metilviológeno (MV) y H2O2. En particular, se detectó un incremento en el nivel de carbonilación de la proteína CDKA;1 junto con una reducción en la formación del complejo con la CycD. Pero, debido a que estas proteínas poseen una expresión temporal y sitio específica, es un inconveniente su purificación para llevar adelante estudios moleculares para establecer si esta oxidación es un proceso general y azaroso o si existen aminoácidos específicos más susceptibles a la carbonilación que pudieran alterar la formación del complejo. Las MPTs poseen un papel regulador central en la modulación de la interacción entre proteínas. A partir de la realización de un modelado por homología de las secuencias P23111 (CDC2_MAIZE, que corresponde a la proteína CDKA;1) y la B6TAD6 (B6TAD6_MAIZE, CycD6;1) y de un análisis bioinformático predictivo se localizaron aminoácidos blancos posibles de MPTs de tipo redox. A la par de los estudios in silico, y para poder llevar adelante los estudios a nivel molecular, se optimizaron las condiciones de cultivo de la bacteria Escherichia coli para la producción de las proteínas ZmCDKA;1 y ZmCycD6;1 recombinantes mediante el Método de Superficie de Respuesta. Se pudo verificar que ambas proteínas eran entidades estables, plegadas correctamente, capaces de interaccionar y que su unión poseía actividad biológica de kinasa. A través de estudios de oxidación in vitro de la CDKA;1 recombinante se pudo identificar la formación de ácido piroglutámico como producto de la carbonilación irreversible del residuo de prolina del motivo PSTAIRE de unión a ciclina. Esta oxidación específica podría ser responsable de la variación en la afinidad determinada al comparar los parámetros cinéticos (kon y koff) de la interacción del complejo CDKA;1 nativa y oxidada con la CycD6;1.\nEn la búsqueda de MPTs redox reversibles, se identificó a la Met ubicada en la posición 58 de la CDKA;1 como otro aminoácido susceptible a oxidación in vitro, pero su relevancia biológica, es decir su ocurrencia in vivo y la reversión por las MSR, queda aún por ser demostrada. De igual manera, la sensibilidad a la nitración de la tirosina in vitro determinada para la CDKA;1 podría ser un indicio de su participación en la regulación de su función. Las MSR actúan revirtiendo la oxidación de la metionina sulfóxido (MetSO) a Met. Esta familia de proteínas está compuesta por las tipo A (MSRA) y las tipo B (MSRB) específicas para los enantiómeros MetSO-S y -R, respectivamente. Si bien ha sido claramente establecida la función enzimática, resta aún comprender el rol biológico durante la señalización por MTPs redox en la fisiología normal y la respuesta al estrés abiótico. Dentro del contexto de posibles estrategias de aclimatación para incrementar la tolerancia al estrés abiótico se evaluó en plantas de Arabidopsis thaliana la preexposición a nitroprusiato de sodio (SNP), donante de óxido nítrico (NO), como mecanismo de reducción de la fitotoxicidad del cadmio. De manera interesante se pudo concluir que la familia de las MSR forma parte de la respuesta celular a la presencia del metal, y que el pretratamiento con NO actúa como modulador del sistema antioxidante vegetal al interferir con la respuesta oxidativa y prevenir la inducción de la expresión de los genes MSRs durante el estrés por cadmio. Se iniciaron estudios con mutantes por inserción de T-ADN de A thaliana para los genes de las MSR con el fin de dilucidar el papel que cada isoforma tendría en la respuesta al metal.\nLos resultados expuestos en este trabajo de tesis indican que las MPTs redox son un mecanismo de integración de las señales en respuesta al estrés abiótico. En\nparticular, las experimentadas por la CDKA;1 que impactan sobre su interacción con las CycDs, modulando la funcionalidad del complejo frente a un desequilibrio redox que detendría la proliferación celular, permitiendo derivar recursos a la maquinaria de defensa celular, como puede ser entre otros, las enzimas MSR.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Biológicas