El rol del acido hilurónico en el metabolismo oxidativo y en los sistemas de señales intracelulares en la capacitacion del espermatozoide criopreservado bovino

• Autores: Fernández, Silvina
• Año de publicación: 2017
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Córdoba, Mariana
• Materia: ACIDO HIAKURONICO; CAPACITACION; HEPARINA; METABOLISMO; SEÑALES INTRACELULARES; ESPERMATOZOIDE DE BOVINO; HYALURINIC ACID; CAPACITATION; HEPARIN; METABOLISM; INTRACELULAR SIGNALS; BOVINE SPERMATOZOA; BOVINOS; ESPERMATOZOIDES; CRIOPRESERVACION; ACIDO HIALURONICO; METABOLISMO OXIDATIVO; CAPACITACIÓN ESPERMÁTICA; Reproducción
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Hyaluronic acid, a high molecular weight non-sulfated linear glycosaminoglycan, is present in the spermatic reservoir of oviductal epithelium and uterine fluids of ruminants. The main membrane receptor of hyaluronic acid (CD44) is a glycoprotein located in the bovine oviduct, where the binding of hyaluronic acid with its receptor would play a role in oocyte maturation, sperm storage, sperm capacitation and interactions related with fertilization. Heparin is a glycosaminoglycan present in the bovine female genital tract, which is frequently used in this species as a physiological inductor of sperm capacitation in vitro.\nDifferent enzymes are involved in signal transduction during sperm capacitation, including adenylate cyclase, protein kinase A, tyrosine kinase and protein kinase C. In sperm cells the participation of these enzymes has been identified not only in capacitation but also in acrosome reaction and sperm motility. Sperm cells are metabolically active because they possess enzymes necessary to carry out various pathways, such as glycolysis, Krebs cycle and mitochondrial respiratory chain. The objective of these pathways is energy production, since sperm capacitation requires abundant energy for its induction and maintenance. Sperm metabolism is composed of numerous highlighted enzymes in bovine sperm such as lactate dehydrogenase, creatine kinase and isocitrate and malate dehydrogenase of the Krebs cycle.\nReports from other authors and results previously obtained in our laboratory justify the need for further research regarding the role of hyaluronic acid in capacitation, so the aim of the thesis was to determine changes in intracellular signals (membrane adenylate cyclase, tyrosine kinase and protein kinase C), enzyme activities (lactate dehydrogenase, creatine kinase, malate dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase) and oxygen consumption using pyruvate and lactate as oxidative substrates in cryopreserved bovine spermatozoa during capacitation with heparin or hyaluronic acid, which could lead to optimize the preparation of the male gamete for bovine oocyte fertilization in vitro.\nIn the present study, the optimal concentration found for hyaluronic acid capacitation and maintenance of sperm viability was 1000 ?g/ml with 60 minutes of incubation. The induction capacitation in cryopreserved bovine sperm by heparin or hyaluronic acid would be involving different intracellular signal mechanisms. These differences would explain why both inducers require different incubation times and concentrations. Although capacitation induced by hyaluronic acid was lower than that registered by heparin, both glycosaminoglycans promoted intracellular changes that allowed true acrosome reaction in vitro induced by lysophosphatidylcholine in bovine sperm.\nOur results suggest that to maintain sperm viability and capacitation the combination of pyruvate and lactate is the best choice to ensure an active metabolism in the gamete. So, with lactate and pyruvate provision in the incubation medium, hyaluronic acid causes a metabolic pattern where the carbon skeletons are used by lactate dehydrogenase, generating lactate, which is not derived to pyruvate to produce energy through Krebs cycle and respiratory chain. Hyaluronic acid maintains a metabolism characterized by the participation of lactate dehydrogenase, creatine kinase, isocitrate and malate dehydrogenase NADP-dependent enzymes to produce enough energy and coenzymes for sperm capacitation. In contrast, heparin capacitation produces a mitochondrial oxidative metabolism, confirmed by the increase in oxygen consumption caused by this inducer together with increased isocitrate and NAD-dependent malate dehydrogenase activities and lower lactate dehydrogenase and creatine kinase activities.\nThe capacitation blocking and the decrease of oxidative metabolism by the presence of membrane adenylate cyclase, protein kinase C and tyrosine kinase inhibitors in sperm samples incubated with heparin suggest that capacitation and oxidative metabolism are modulated by these enzymes. In contrast, the inhibition of membrane adenylate cyclase does not completely block hyaluronic acid induction of capacitation and does not affect mitochondrial oxygen consumption, but decreases lactate dehydrogenase and creatine kinase activities. When protein kinase C and tyrosine kinase were inhibited, hyaluronic acid capacitation proved to be mediated by these enzymes and by isocitrate and NADP-dependent malate dehydrogenase activities. Heparin induced capacitation would be mediated by tyrosine kinase, while hyaluronic acid capacitation induction would involve protein kinase C as well.\nIn conclusion, heparin and hyaluronic acid are two glycosaminoglycans capable to capacitate bovine sperm involving different metabolic pathways and intracellular signals regulation dependent on membrane adenylate cyclase, protein kinase C and tyrosine kinase to obtain fertilizing capacity. This thesis contributes to optimize the conditions of cryopreserved bovine sperm capacitation in vitro, which will impact on in vitro fertilization in this species. Through the increase in the knowledge regarding intracellular mechanisms and changes in sperm metabolism the use of hyaluronic acid as a physiological sperm capacitation inducer is validated.
Fil: Fernández, Silvina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Buenos Aries, Argentina
Fil: Fernández, Silvina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Instituto de Investigación y Tecnología en Reproducción Animal (INITRA). Buenos Aries, Argentina
El ácido hialurónico, glicosaminoglicano lineal no sulfatado de alto peso molecular, se encuentra presente en el epitelio del reservorio oviductal espermático y en los fluidos uterinos de los rumiantes. El principal receptor de membrana de ácido hialurónico (CD44) es una glicoproteína localizada en el oviducto bovino, en donde la unión del ácido hialurónico al receptor cumpliría un rol en la maduración del ovocito, el almacenamiento de espermatozoides, la capacitación espermática y en interacciones vinculadas con la fertilización. La heparina es también un glicosaminoglicano presente en el tracto genital de la hembra bovina, que se utiliza frecuentemente en esta especie como inductor fisiológico de la capacitación espermática in vitro.\nDiferentes enzimas se encuentran involucradas en la transducción de señales durante la capacitación espermática, entre ellas adenilato ciclasa, proteína quinasa A, tirosina quinasa y proteína quinasa C. En células espermáticas se ha identificado la participación de estas enzimas no sólo en la capacitación sino también en la reacción acrosomal y la motilidad espermática.\nLos espermatozoides son células metabólicamente activas debido a que poseen las enzimas necesarias para llevar a cabo vías metabólicas como la glucólisis, el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria mitocondrial. El objetivo de dichas vías es la obtención de energía, ya que la capacitación espermática requiere de abundante energía para su inducción y sostenimiento. El metabolismo espermático está compuesto por numerosas enzimas entre las que se destacan en el espermatozoide bovino, lactato deshidrogenasa, creatina quinasa y enzimas del ciclo de Krebs como isocitrato y malato deshidrogenasa.\nLos reportes de otros autores y los resultados obtenidos previamente en nuestro laboratorio justifican la necesidad de profundizar la investigación sobre el rol del ácido hialurónico en la capacitación, es así que el objetivo general de la tesis fue determinar en el espermatozoide bovino criopreservado durante la capacitación con heparina o ácido hialurónico, los cambios en señales intracelulares (adenilato ciclasa de membrana, tirosina quinasa y proteína quinasa C), de actividades enzimáticas (lactato deshidrogenasa, creatina quinasa, malato deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa) vinculadas con la obtención de energía y consumo de oxígeno, utilizando piruvato y lactato como sustratos oxidativos, para optimizar la preparación de la gameta en la fertilización del ovocito bovino in vitro.\nEn el presente estudio, la concentración óptima hallada para la capacitación con ácido hialurónico y el mantenimiento de la viabilidad espermática fue de 1000 ?g/ml con 60 minutos de incubación. En la capacitación del espermatozoide bovino criopreservado inducida por heparina o ácido hialurónico, se estarían involucrando distintos mecanismos de señales intracelulares, estas diferencias serían las responsables de que los inductores requieran diferentes tiempos de incubación y concentraciones. La capacitación inducida con ácido hialurónico fue menor que la alcanzada por heparina, sin embargo ambos glicosaminoglicanos promovieron cambios intracelulares que permitieron la reacción acrosomal verdadera in vitro inducida por lisofosfatidilcolina en el espermatozoide bovino.\nA partir de los resultados obtenidos se infiere que para mantener la viabilidad y la capacitación espermática es la combinación de piruvato y lactato la mejor opción para asegurar un metabolismo activo en la gameta. Es así que bajo condiciones de provisión de lactato y piruvato en el medio de incubación, el ácido hialurónico provoca un patrón metabólico donde los esqueletos carbonados son usados por la lactato deshidrogenasa, generando lactato en el medio de incubación, que no se deriva a la obtención de piruvato para producir energía a través del ciclo de Krebs y la cadena respiratoria. Este último glicosaminoglicano mantiene un metabolismo caracterizado por la participación de las enzimas lactato deshidrogenasa, creatina quinasa, isocitrato y malato deshidrogenasa dependientes de NADP para producir energía y coenzimas suficientes para la capacitación espermática. En cambio, la heparina desencadena un metabolismo oxidativo mitocondrial, confirmado por el aumento del consumo de oxígeno que provoca este inductor, junto con un aumento de la actividad de isocitrato y malato deshidrogenasa dependientes de NAD, y baja actividad de lactato deshidrogenasa y creatina quinasa.\nRespecto a las señales intracelulares estudiadas, el bloqueo de la capacitación y descenso del metabolismo oxidativo en muestras espermáticas capacitadas con heparina en presencia de los inhibidores de adenilato ciclasa de membrana, proteína quinasa C y tirosina quinasa sugieren que se requiere de la actividad de dichas enzimas para modular la capacitación y el metabolismo oxidativo. Contrariamente, la inhibición de adenilato ciclasa de membrana no bloquea completamente la inducción de la capacitación producida por el ácido hialurónico y no afecta al consumo de oxígeno mitocondrial, pero disminuye la actividad de lactato deshidrogenasa y creatina quinasa. Al inhibir proteína quinasa C y tirosina quinasa, la capacitación con ácido hialurónico evidenció estar mediada por estas enzimas, al igual que la actividad de isocitrato y malato deshidrogenasa dependientes de NADP. La motilidad en la capacitación con heparina estaría mediada por tirosina quinasa, y en la capacitación con ácido hialurónico por proteína quinasa C y tirosina quinasa.\nLa heparina y el ácido hialurónico son dos glicosaminoglicanos capaces de provocar la capacitación en el espermatozoide bovino involucrando diferentes vías metabólicas y regulación de señales intracelulares dependientes de adenilato ciclasa de membrana, proteína quinasa C y tirosina quinasa, es decir diferentes caminos para alcanzar la capacidad fertilizante. El presente trabajo de tesis contribuye a optimizar las condiciones de capacitación in vitro de semen criopreservado bovino, que impactará sobre la fertilización in vitro de esta especie. A través del conocimiento de los mecanismos intracelulares y las variaciones del metabolismo espermático, se valida el uso de ácido hialurónico como inductor fisiológico de la capacitación espermática.
Reproduccion animal
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Veterinarias