Estudio de la dinámica y función de la proteína heterocromática 1 (HP1y) durante el proceso de miogénesis

• Autores: Charó, Nancy Lorena
• Año de publicación: 2015
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Fernández Tomé, María; Piwien Pilipuk, Graciela; Majowicz, Mónica; Rey, Osvaldo; Adamo, Ana
• Materia: HP1y [Gamma]; Miogénesis; Proteína Heterocromática; HP1y; Myogenesis; Heterochromatin protein; Ciencia de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

In a previous study we show that upon induction of 3T3-L1 preadipocytes differentiation, the nuclear non-histone protein the HP1y transiently concentrates in the nuclear pole opposite to the MTOC. Then, we investigated whether HP1y nuclear polarization occurred in other processes of cell differentiation, and for this we analyzed the subcellular distribution of HP1y during myogenesis. Using indirect immunofluorescence and confocal microscopy we observed that in C2C12 myoblasts, HP1y, a protein so far described only in the nucleus, besides being located in euchromatic and heterochromatic nuclear regions as already reported (Minc et al., 1999; Minc et al., 2000), remarkably localizes in the cytoplasm. Four days post-induction of differentiation, myoblasts become myotubes where HP1y localized predominantly in the cytoplasm exhibiting a filamentous pattern longitudinally arranged. On the contrary, HP1a, another member of the HP1 family, is present in the nucleus of both myoblasts and myotubes. Western blot analysis of nuclear and cytoplasmic fractions of myoblasts and myotubes showed that HP1y is present in both fractions. In mature myotubes and myofibrils isolated from muscle of mice´s limbs HP1y also localizes in the cytoplasm but in transversal filaments. According to HP1y filamentous aspect observed in myotubes, we explored the possible association with proteins of the cytoskeleton, and surprisingly we found that HP1y interacts with actin and tubulin. Finally, to investigate the functional importance of HP1y during myogenesis, C2C12 myoblasts were generated in which the expression of HP1y was stably interfered using shRNA. The C2C12HP1y- are unable to differentiate or give rise to thin myotubes. In summary, HP1y is not exclusively localized in the nucleus and it is required for the proper generation of the myotubes.
Fil: Charó, Nancy Lorena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
En trabajo previo de nuestro laboratorio se demostró que la proteína nuclear no histónica HP1y se concentra transitoriamente en el polo del núcleo opuesto al centro organizador de microtúbulos al inducir la diferenciación de preadipocitos 3T3-L1. Nos preguntamos si la polarización nuclear de HP1y ocurría en otros procesos de diferenciación celular, y para ello analizamos la distribución de HP1y durante el proceso de miogénesis. Empleando inmunofluorescencia indirecta y microscopía confocal observamos que en mioblastos C2C12, HP1y además de localizarse en regiones nucleares eucromáticas y heterocromáticas como ya se había reportado (Minc et al., 1999; Minc et al., 2000), llamativamente se localiza en el citoplasma. Luego de 4 días de inducida la diferenciación, los mioblastos dan lugar a la formación de miotubos donde HP1y se localiza mayoritariamente en el citoplasma adoptando un aspecto filamentoso muy marcado, que se dispone en forma longitudinal al miotubo. En cambio, HP1a, otro miembro de la familia de las HP1 altamente homóloga a la isoforma y, se encuentra sólo presente en el núcleo tanto de mioblastos como de miotubos. Análisis por Western blot de las fracciones nucleares y citoplasmáticas de mioblastos y miotubos confirmaron que HP1y se encuentra en ambas fracciones. De manera relevante, observamos que HP1y se localiza en el citoplasma en forma de filamentos que se estructuran transversalmente tanto en miotubos C2C12 maduros como en miofibrillas aisladas de músculo esquelético de ratón. En función de su distribución filamentosa observada en miotubos y en miofibrillas de músculo de ratón, investigamos su posible asociación con proteínas que forman el citoesqueleto, y así encontramos que HP1y interacciona con actina y tubulina, hallazgo muy novedoso descripto por primera vez. Finalmente, para investigar la importancia funcional de HP1y durante el proceso de miogénesis, se generaron mioblastos C2C12 en los que se interfirió la expresión de HP1y de manera estable empleando ARNsh, células que luego fueron inducidas a diferenciarse. Al cabo de 4 días de diferenciación, las C2C12 HP1y- mostraron diferentes fenotipos, desde la formación de miotubos delgados atróficos hasta la inhibición del proceso miogénico, dependiendo ello del nivel de interferencia de HP1y. En síntesis, HP1y no es una proteína de exclusiva localización nuclear y cumple un rol esencial en la correcta formación del miotubo.
Biología Molecular Médica
Doctora de la Universidad de Buenos Airea en Farmacia y Bioquímica