Interacción del receptor muscarínico M2 con arrestinas no visuales y su modulación por anticuerpos séricos de pacientes chagásicos crónicos

• Autores: Carrera Páez, Laura Camila
• Año de publicación: 2021
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de maestría
• Colaborador/a o director/a de tesis: Waldner, Claudia Inés; Goin, Juan Carlos; Canellada, Andrea Mercedes; Balerio, Graciela Noemí; Mongini, Claudia
• Materia: Autoanticuerpo; Receptor muscarínico M2; Modulador alostérico; Chagas; ?-arrestina; Disautonomía; Autoantibody; ?-arrestin; M2 muscarinic receptor; Allosteric modulator; Chagas; Dysautonomia; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Previous studies have demonstrated a strong correlation between serum levels of IgG autoantibod-ies against M2 muscarinic receptors (M2R Ab) and the extent of parasympathetic dysfunction in chronic chagasic patients. These antibodies recognize the second extracellular loop (II-ECL) of the human M2R and activate this receptor, thus eliciting negative inotropic and chronotropic effects through Gi protein activation in rat cultured cardiomyocytes and isolated atria. In contrast, preincu-bation of heterologous cells expressing M2R or rat atria with such antibodies, followed by the addi-tion of a muscarinic agonist, results in the inhibition of agonist-mediated effects. These data suggest that the chronic exposure of cardiac M2R to serum M2R Ab could attenuate of acetylcholine-medi-ated cardiac effects, thereby contributing to the development of parasympathetic dysfunction in chronic chagasic patients. Two mechanisms underlying the antibody-mediated inhibition of musca-rinic agonist activity through M2R have been proposed: (I) M2R desensitization/internalization me-diated by GRK and ?-arrestins; (II) negative allosteric modulation. In this study, the feasibility of these mechanisms was examined by assessing the effects of M2R Ab on the interaction between M2R and ?-arrestins (Arr-2 or Arr-3), in the presence or absence of agonist, using bioluminescence resonance energy transfer (BRET).\nCarbachol treatment of HEK 293T cells expressing M2R fused to Renilla luciferase (M2R -RLuc) and Arr-2 (or Arr-3) fused to yellow fluorescent protein (Arr-2-YFP or Arr-3-YFP) (BRET pair) stimu-lated the interaction between the M2R and Arr-2 (or Arr-3) only when GRK2 was coexpressed. In contrast, treatment of cells with serum IgG fractions from dysautonomic chagasic patients seroposi-tive for M2R Ab (Ch IgG+) or IgG from healthy noninfected individuals (control IgG) did not promote the translocation either ?-arrestin to the M2R. Preincubation of cells coexpressing the BRET pair and GRK2 with Ch IgG+ followed by the addition of carbachol resulted in carbachol-induced inhibition of Arr-2 recruitment (but not of that of Arr-3) to the M2R, while control IgG was unable to modulate the translocation of Arr-2 o Arr-3. The inhibitory effect of Ch IgG+ on agonist-induced Arr-2 translo-cation to the M2R (a) was neutralized by a synthetic peptide with the amino acid sequence of the II-ECL of the human M2R, thus demonstrating that serum inhibitory antibodies specifically interact with the M2R; (b) was dependent on the exposure time of M2R to muscarinic autoantibodies; (c) was consistent with a noncompetitive inhibition model, showing a decrease in agonist efficacy with no changes in potency; (d) was not mimicked by the Fab fraction derived from Ch IgG+, except in the presence of an anti-human Fab antibody, suggesting that this inhibitory effect is mediated by recep-tor crosslinking.\nAs regards the pharmacodynamic mechanism underlying the inhibitory effect of M2R Ab on agonist-induced M2R/Arr-2 interaction, the present data suggest that this effect does not likely oc-cur as a consequence of M2R homologous regulation. First, these antibodies cannot stimulate ?-arrestin recruitment to the M2R. Since agonist-induced M2R desensitization is associated with M2R/?-arrestin interaction, it is unlikely that these antibodies can promote M2R desensitization. Second, M2R Ab cannot induce arrestin-dependent or -independent M2R internalization in HEK 293T cells, according to recently published data. Third, agonist-induced Arr-3 translocation is not affected by M2R Ab, suggesting that the antibody-bound receptor is not desensitized nor internalized. Con-versely, the fact that M2R Ab interact with the II-ECL at the common allosteric site of the M2R and promote a selective, noncompetitive inhibition of agonist-induced Arr-2-recruitment suggests that these autoantibodies function as biased, negative allosteric modulators of agonist efficacy.
Fil: Carrera Páez, Laura Camila. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
Estudios previos han demostrado una fuerte correlación entre los niveles séricos de autoanticuer-pos IgG contra receptores muscarínicos M2 (Ac anti-RM2) y el grado de disfunción parasimpática en pacientes chagásicos crónicos. Estos anticuerpos reconocen el segundo loop extracelular (II-LEC) del RM2 humano y activan a este receptor, promoviendo efectos inotrópicos y cronotrópicos negativos a través de la activación de proteínas Gi en miocardiocitos cultivados y aurículas aisladas de rata. En contraste, la preincubación de células heterólogas expresando RM2 o aurículas de rata con estos anticuerpos, seguida del agregado de un agonista muscarínico, resulta en la inhibición de los efectos del agonista. Estos resultados sugieren que la exposición crónica de los RM2 cardíacos a los Ac anti-RM2 séricos podría atenuar los efectos cardíacos de acetilcolina, contribuyendo al desarrollo de dis-función parasimpática en pacientes chagásicos crónicos. Se han propuesto dos mecanismos subya-centes al efecto inhibitorio de los Ac anti-RM2 sobre la actividad del agonista muscarínico mediada por RM2: (I) desensibilización y/o internalización del RM2 mediada por GRK y ?-arrestinas; (II) mo-dulación alostérica negativa. En este estudio se examinó la factibilidad de ambos mecanismos, eva-luando los efectos de los Ac anti-RM2 sobre la interacción entre el RM2 y las ?-arrestinas (Arr-2 o Arr-3) en presencia y ausencia de agonista, mediante la metodología de transferencia de energía bioluminiscente en resonancia (BRET).\nEl tratamiento con carbacol de células HEK 293T expresando RM2 fusionado a la luciferasa de Renilla (RM2-RLuc) y Arr-2 (o Arr-3) fusionada a la proteína fluorescente amarilla (Arr-2-YFP o Arr-3-YFP) (par BRET) estimuló la interacción entre RM2 y Arr-2 (o Arr-3) sólo cuando GRK2 fue coexpre-sada. Sin embargo, el tratamiento de las células con fracciones IgG séricas de pacientes chagásicos disautonómicos seropositivos para Ac anti-RM2 (IgG Ch+) o IgG de individuos no infectados (IgG control) no logró promover la traslocación de ninguna ?-arrestina al RM2. La preincubación de las células coexpresando el par BRET y GRK2 con IgG Ch+, seguida del agregado de carbacol, resultó en la inhibición del reclutamiento de Arr-2 (pero no de Arr-3) al RM2, mientras que IgG control fue incapaz de modular la traslocación de Arr-2 o Arr-3. El efecto inhibitorio de IgG Ch+ sobre la traslo-cación de Arr-2 al RM2 estimulada por agonista: (a) fue neutralizado por un péptido sintético con la secuencia aminoacídica del II-LEC del RM2 humano, demostrando que los anticuerpos inhibitorios séricos interactúan específicamente con el RM2; (b) fue dependiente del tiempo de exposición de los RM2 celulares a los Ac anti-RM2; (c) se ajustó a un modelo de inhibición no competitiva, exhi-biendo una reducción en la eficacia del agonista, sin cambios en su potencia; (d) no fue reproducido por la fracción Fab derivada de IgG Ch+, salvo en presencia de un anticuerpo anti-Fab humano, su-giriendo que este efecto inhibitorio está mediado por crosslinking de receptores.\nEn cuanto al mecanismo farmacodinámico del efecto inhibitorio de los Ac anti-RM2 sobre la interacción RM2/ Arr-2 estimulada por agonista, los resultados de este trabajo sugieren que este efecto no ocurre, probablemente, como consecuencia de la regulación homóloga del receptor. En primer lugar, estos anticuerpos no logran estimular el reclutamiento de ?-arrestinas al RM2. Dado que la desensibilización del RM2 por agonista está asociada a la interacción RM2/?-arrestina, es im-probable que estos anticuerpos puedan promover la desensibilización de RM2. En segundo lugar, los Ac anti-RM2 no logran estimular la internalización del RM2 en células HEK 293T, ya sea en forma dependiente o independiente de arrestinas, de acuerdo con datos recientemente publicados. En tercer lugar, la traslocación de Arr-3 al RM2 estimulada por agonista no es afectada por los Ac anti-RM2, sugiriendo que el complejo receptor/anticuerpo no se encuentra ni desensibilizado ni interna-lizado. Alternativamente, el hecho de que los Ac anti-RM2 interactúan con el II-LEC en el sitio alos-térico común del RM2 y promueven una inhibición selectiva y no competitiva del reclutamiento de Arr-2 inducido por agonista sugiere que estos autoanticuerpos actúan como moduladores alostéri-cos negativos y sesgados de la eficacia del agonista.
Magíster de la Universidad de Buenos Aires en Biología Molecular Médica