Toxinas proteicas del veneno de serpientes del género Dendroaspis que reconocen receptores colinérgicos muscarínicos

• Autores: Kornisiuk, Edgar Ernesto
• Año de publicación: 1998
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Jerusalinsky, Diana Alicia
• Materia: TOXINAS MUSCARINICAS; RECEPTORES COLINERGICOS MUSCARINICOS; MAMBA; NEUROTOXINAS; SUBTIPOS DE RECEPTOR MUSCARINICO; NEUROTRANSMISION COLINERGICA; LIGANDOS MUSCARINICOS; MUSCARINIC TOXINS; CHOLINERGIC MUSCARINIC RECEPTORS; MAMBA; NEUROTOXINS; MUSCARINIC RECEPTOR SUBTYPES; CHOLINERGIC NEUROTRANSMISSION; MUSCARINIC LIGANDS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Hace diez años se reportó la existencia de dos proteínas, MTx1 y MTx2, del veneno de la mambaverde oriental (Dendroaspis angusticeps) que inhibieron la unión de ligandos muscarínicos encerebro de rata. Actualmente se han aislado más de diez toxinas muscarínicas (MTxs) de la mambaverde oriental, la mamba negra (D. polylepis) y la mamba verde occidental (D. viridis). Estastoxinas poseen 65-66 aminoácidos, con cuatro puentes disulfirro que les confieren una estructurade "tres dedos", tal como las α-neurotoxinas (bloqueantes de receptores nicotínicos), lasdendrotoxinas (bloqueantes de canales de K+) y las fasciculinas (inhibidoras de laacetilcolinesterasa). Existen cinco subtipos de receptores colinérgicos muscarínicos (m1-m5), aunque sólo puedendiscriminarse dificilmente cuatro subtipos farmacológicos (M1-M4) por agentes poco selectivos,que no pemiiten una clasificación confiable y, en consecuencia, una identificación clara. Nuestros experimentos de unión especifica en tejidos nativos pemiitieron sugerir que ambastoxinas, MTxl y MTx2, se unen selectivamente al subtipo farmacológico M1 de receptormuscarínico. Luego demostramos que ambas toxinas presentan alta afinidad y selectividad por losreceptores muscarínicos humanos clonados m1 y m4, con muy bajas afinidades relativas por losotros. Estos resultados se confirmaron por experimentos de unión específica en diferentes tejidoscentrales y periféricos de rata y conejo; se demostró una unión de alta afinidad en el hipocampo,rico en receptores m1 y m4, y en el estriado, rico en m4, pero no se observó interacción enpáncreas, rico en m3, ni en auricula, rica en m2. El patrón de selectividad de MTxl fue m1 ≈ m4 >> m5 > m3, m2, siendo MTxl más potente que MTx2, pero con menor capacidad discriminativaentre m1 y m4. Tanto MTxl como MTx2 se comportaron como agonistas muscarínicos, facilitando laconsolidación de la memoria cuando se inyectaron en el hipocampo de ratas entrenadas en unatarea de evitación inhibitoria. En el conducto deferente de conejo las toxinas actuaron como McN-A 343 y CPCP, agonistas relativamente selectivos por el receptor M1, reduciendo lascontracciones fásicas del músculo liso, aunque los efectos de las toxinas no resultaron reversibles. En la misma preparación, las MTxs parecieron tener un efecto sobre los receptores adrenérgicos,que fue reversible. Además, MTxl y MTx2 resultaron capaces de desplazar la unión de ³H-prazosin,un antagonista α-adrenérgico, a membranas de corteza cerebral y conducto deferente derata y conejo. La unión de MTxl y MTx2 a los receptores muscarínicos resultó irreversible,mientras que a los adrenérgicos resultó reversible. Recientemente hemos aislado dos fracciones proteicas (7000-8000 Da) del veneno de D. viridisque parecen ser ligandos potentes y específicos para subtipos de receptores muscarínicos. Una deellas, DvMT4, mostró selectividad por el subtipo m4, mientras que otra, DvMT3-4, exhibióselectividad por los subtipos m3 y m4. Dada la carencia de agentes muscarínicos selectivos, estas MTxs resultan muy útiles para localizary mapear subtipos muscarínicos en el sistema nervioso central, para caracterizados y estudiar susfunciones en órgano aislado o in vivo. La familia de las Msz ha ido creciendo rápidamente y parecen ser ligandos selectivosextremadamente promisorios para el estudio del rol y la distribución de los subtipos de receptoresmuscarínicos. La comparación de las secuencias permitió definir importantes residuos y regionesde las toxinas, probablemente responsables de su selectividad y acción agonista/antagonista. Estopodría llevar al desarrollo de nuevos ligandos muscarínicos aún más selectivos, tal vez másapropiados como agentes terapéuticos.
Ten years ago, two proteins from the venom of the Eastern green mamba snake (Dendroaspisangusticeps), MTxl and MTx2, which inhibited the binding of muscarinic ligands to rat brain,were reported. Actually, more than ten muscarinic toxins (Msz) have been isolated from Easterngreen mamba, black mamba (D. polylepis) and Western green mamba (D. viridis). All these toxinshave 65-66 aminoacids, with four disulphide bonds that confer a “three fingered” structure, sharedby α-neurotoxins (nicotinic receptor blockers), dendrotoxins (K+ channel blockers) and fasciculins (acetylcholinesterase inhibitors). There are five muscarinic acetylcholine receptor subtypes (m1-m5), although only fourpharmacological subtypes (M1-M4) are hardly discriminated by poorly selective agents, not enoughto enable a reliable classification and a defined identification. From radioligand binding experiments in native tissues we have suggested that both toxins, MTxland MTx2, bound selectively to M1 pharmacological subtype of muscarinic receptor. Then, wedemonstrated that both toxins have high affinity and selectivity for m1 and m4 cloned humanmuscarinic receptors, with rather low relative affinity for the others. These results were confirmedby binding experiments in different central and peripheral tissues from rat and rabbit. High affinitybinding was found in the hippocampus, rich in m1 and m4 receptors, and striatum, rich in m4, butno interaction was found in pancreas, rich in m3, nor in atria, rich in m2. The pattern of selectivityof MTxl was m1 ≈ m4 >> m5 > m3, m2, being MTxl more potent than MTx2, but lessdiscriminative between m1 and m4. Both MTxl and MTx2 behaved as muscarinic agonists when infused into the hippocampus of ratstrained in an inhibitory avoidance task, facilitating memory consolidation. On rabbit vas deferensthe toxins acted as the relatively M1 selective agonists McN-A 343 and CPCP in reducing thetwitch response of the smooth muscle, but the effects of toxins were not reversible. In the samepreparation, MTxs seemed to have an effect on adrenergic receptors. Then it was shown that MTxl and MTx2 were able to displace ³H-prazosin binding, an α-adrenergic antagonist, to rat andrabbit cerebral cortex and vas deferens membranes. However, MTxl and MTx2 binding tomuscarinic receptors appear irreversible, while it was reversible to adrenergic receptors. Recently, we have isolated two protein fractions (7000-8000 Da) from D. viridis venom thatappear to be potent and specific ligands for subtypes of muscarinic receptors. One of them, DvMT4, showed selectivity for m4 subtype, while the other, DvMT3-4, exhibited selectivities forboth m3 and m4 subtypes. Due to the lack of selective muscarinic agents, MTxs are useful to localise and to map muscarinicreceptor subtypes in the central nervous system, to characterise them and to study their functionseither in isolated organs or in vivo. The MTx family has been rapidly growing up and they appear as extremely promising selectiveligands to study the role and distribution of muscarinic receptor subtypes. The comparison ofsequences allowed to define important residues or regions in the toxins, putatively responsible oftheir selectivity and agonist/antagonist action. This would lead to the development of new moreselective muscarinic ligands, that would likely be more appropriate as therapeutic agents.
Fil: Kornisiuk, Edgar Ernesto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.