Inhibición de la síntesis de biopelículas en virotipos patógenos de E. coli mediante ARNs antisentido

• Autores: Gonzalez Machuca, Adrian Gustavo
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de maestría
• Colaborador/a o director/a de tesis: Sarnacki, Sebastián H.; Quiroga, Cecilia; Di Conza, José; Sobrero, Patricio; Power, Pablo
• Materia: sRNA; Biopelículas; Curli; McaS
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Gonzalez Machuca, Adrian Gustavo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
Los diversos virotipos de Escherichia coli (E. coli) son responsables de causar distintos\ncuadros infecciosos en seres humanos y otros animales. En particular, las infecciones del tracto\nurinario (ITUs) causadas por E. coli uropatógena (UPEC) y la colitis hemorrágica por E. coli\nenterohemorrágica (EHEC) son algunas de las afecciones de mayor frecuencia alrededor del\nmundo, lo que las convierte en un problema de relevancia en la salud pública.\nAlgunas bacterias de estos virotipos son capaces de formar biopelículas, las cuales están\ncompuestas principalmente por la adhesina curli y fosfoetanolamina (PETN) celulosa. Estos\ncomponentes contribuyen en la patogénesis bacteriana participando activamente en el proceso\nde adherencia y colonización de distintos epitelios celulares. Asimismo, contribuyen con la\nadherencia a productos alimenticios y dispositivos médicos, pudiendo persistir por períodos\nprolongados resultando en consecuencias sanitarias y económicas graves. La formación de las\nbiopelículas brinda además una barrera de protección contra los antimicrobianos y la acción\ndel sistema inmune del hospedador.\nLa formación de biopelículas a su vez le brinda a las bacterias un ambiente propicio\npara el intercambio de material genético colaborando con la diseminación de genes de\nresistencia a antimicrobianos (ARGs, por sus siglas en inglés) y de factores de patogenicidad\ncodificados en elementos genéticos móviles (EGMs). Es así que las biopelículas junto con otros\nfactores, como el uso empírico de antimicrobianos para el tratamiento de afecciones como las\nITUs causadas por UPEC, contribuyen a la emergencia de aislamientos multidroga-resistentes\n(MDRs) y de resistencia extrema (XDRs). La presión antibiótica contínua resultará en la\nevolución de cepas pandroga resistentes (PDRs) difíciles de erradicar afectando no solo la salud\nhumana, sino también la salud animal y el medio ambiente. Al respecto, la Organización\nMundial de la Salud en su reporte del 2015 emitió varias recomendaciones para hacer frente a\nlas infecciones causadas por bacterias XDR y PDR, entre ellas la generación de nuevas\nestrategias antimicrobianas.\nEl objetivo de este trabajo fue estudiar la capacidad de síntesis de los componentes\nprincipales de las biopelículas de diversos virotipos de E. coli (curli y PETN celulosa) y evaluar\nel efecto inhibitorio que tiene el pequeño ARN (sRNA, por sus siglas en inglés) McaS sobre\nlos genes responsables de la síntesis de dichos compuestos pudiendo tener un impacto sobre la\ncapacidad de adherencia bacteriana. La reducción de esta adherencia permitirá limitar la\ncolonización de un nicho por un patógeno bacteriano y evitará la formación de biopelículas,\nfacilitando la acción de los antimicrobianos.\nA fin de determinar la capacidad de formación de biopelículas de diversos aislamientos\nde E. coli, se caracterizó la capacidad de síntesis de curli y PETN celulosa mediante el análisis\nde los morfotipos y estructura de las macrocolonias, la emisión fluorescente del colorante Rojo\nCongo (RC) y la adherencia al poliestireno de aislamientos de los virotipos UPEC, EHEC y\nSalmonella enterica serovar Enteritidis (S. Enteritidis). Nuestros resultados revelaron una alta\nheterogeneidad con respecto a la síntesis de curli y PETN celulosa entre los aislamientos\nestudiados a diversas temperaturas y a lo largo del tiempo, lo que probablemente tenga un\nimpacto directo sobre los procesos de adherencia y colonización. Entre las bacterias estudiadas,\nse seleccionó al aislamiento UPEC CQ7, que mostró ser una cepa capaz de sintetizar ambos\ncomponentes y de formar biopelículas sobre poliestireno. Su genoma fue secuenciado y\nanalizado empleando métodos in silico, lo que permitió identificar a esta bacteria como parte\ndel grupo clonal ST131, filogrupo B2 y subgrupo fimH30, un perfil asociado a una amplia\ndistribución global. Asimismo el análisis del moviloma permitió caracterizar dos plásmidos,\npCQ7-IncF y pCQ7-IncX4, los cuales poseen la maquinaria necesaria para transferirse por\nconjugación tanto a E. coli como a otras Enterobacterias. El análisis del resistoma llevó a la\nidentificación de 10 ARGs de diversas familias de antimicrobianos (blaTEM-1b, aph(6)-Id,\naph(3??)-Ib, sul2, tetA, mphA, dfrA17, aadA5, sul1 y ??????) en el plásmido pCQ7-IncF,\ncodificados en su mayoría en el integrón In54 y en un transposón compuesto delimitado por\ndos IS26. Además se detectaron otros dos ARGs codificados en el cromosoma de este\naislamiento (ampC y mdtH). La diversidad de ARGs encontrados confirma que UPEC CQ7 es\nun aislamiento clínico MDR. La presencia de estos determinantes de resistencia en pCQ7-IncF\nrefleja la potencialidad de este EGM para contribuir al incremento de la resistencia antibiótica\nmediante la captación de nuevos ARGs y de su diseminación a otras bacterias. Por otra parte,\nse analizó el viruloma de este aislamiento, lo que llevó a la identificación de los genes\ncodificantes de la adhesina curli, así como también genes codificantes de toxinas, sideróforos,\nmecanismos de resistencia a cambios de pH, proteínas autotransportadoras y proteínas de\nevasión de la respuesta inmune. Esto reveló que UPEC CQ7 posee una gran diversidad de\nfactores de virulencia. El análisis de dichos factores contribuyó a dilucidar los posibles\nmecanismos que emplea para provocar cuadros de cistitis e ITUs recurrentes. Finalmente, se\nanalizaron los ARNs no codificantes (ARNnc) presentes en el genoma de esta bacteria, en\nparticular aquellos vinculados al proceso de colonización de las vías urinarias bajas. Este\nanálisis llevó a la identificación de ARNnc de diversas familias, tales como leaders,\nantitoxinas, ARNs antisentido, termoreguladores, riboswitches, reguladores en cis, intrones,\nribozimas, CRISPRs y sRNAs varios de los cuales participan directamente en la regulación de\nla síntesis de factores de virulencia. En particular se comprobó la presencia del sRNA McaS,\nque controla la expresión de los genes involucrados en la síntesis de curli y de formación de\nbiopelículas. Con el fin de evaluar el uso posible de sRNAs como herramientas para la\ninhibición de factores de virulencia en E. coli, se seleccionó al riboregulador McaS y se generó\nun sistema de expresión heterólogo capaz de reducir la síntesis de curli en los distintos virotipos\nde E. coli por interacción con el ARNm del gen csgD y el cofactor Hfq. Se realizó un análisis\npredictivo del sRNA de la cepa E. coli MG1655 que permitió comprobar la presencia de los\nelementos estructurales necesarios para la correcta interacción entre McaS y la región 5?-UTR\ndel ARNm del gen csgD de UPEC CQ7 y Hfq. Por último, se determinó la capacidad de McaS\nprovisto en trans de inhibir la síntesis de los componentes principales de las biopelículas, curli\ny PETN celulosa, tanto en UPEC CQ7 como en otros aislamientos virulentos productores de\nbiopelículas (EHEC y S. Enteritidis). Este estudio resultó en la reducción significativa de la\ncapacidad de adherencia y de síntesis de curli en los aislamientos UPEC CQ7, EHEC CQ146\ny S. Enteritidis ARJEG, y de la disminución de la producción de PETN celulosa en los\naislamientos UPEC CQ7 y S. Enteritidis ARJEG a 28°C a partir de las 48 h de incubación.\nLos resultados obtenidos evidencian que la expresión en trans de McaS puede reducir\neficazmente la formación de biopelículas en distintos virotipos de E. coli y en S. Enteritidis\nARJEG. Este trabajo sienta las bases para el desarrollo de sRNAs sintéticos basados en la\nestructura de McaS que puedan ser útiles como herramientas para inhibir la expresión de genes\ncodificantes de factores de virulencia de bacterias patógenas que mitiguen el proceso de\ninfección y la diseminación de ARGs.
Magíster de la Universidad de Buenos Aires en Biología Molecular Médica