Mecanismos de adaptabilidad a microaerobiosis y estrés oxidativo en Pseudomonas extremaustralis

• Autores: Solar Venero, Esmeralda Clara
• Año de publicación: 2020
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: López, Nancy Irene; Tribelli, Paula María
• Materia: PSEUDOMONAS; MICROAEROBIOSIS; ESTRES OXIDATIVO; ESTRES NITROSATIVO; sRNA; PSEUDOMONAS; MICROAEROBIOSIS; OXIDATIVE STRESS; NITROSATIVE STRESS; sRNA
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS y RNS) se producen en distintas condiciones fisiológicas y ambientales en estrecha relación con las condiciones de aireación. Los mecanismos de defensa contra estas moléculas resultan cruciales para la supervivencia. Pseudomonas extremaustralis es una bacteria antártica con alta resistencia al estrés por lo que es un modelo de interés para el estudio de la adaptabilidad ambiental. Este trabajo explora las respuestas al estrés oxidativo y nitrosativo en distintas condiciones de aireación utilizando enfoques globales y fisiológicos en P. extremaustralis. En aerobiosis se observó la activación de las defensas antioxidantes y poco efecto del estrés generado por el H2O2 en comparación con microaerobiosis. En contraste, el estrés oxidativo en microaerobiosis provocó mayor daño a macromoléculas y menor supervivencia. Los análisis globales realizados (transcriptómica y proteómica) mostraron no solo el despliegue de respuestas a estrés tradicionales sino también la sobreexpresión de genes relacionados con otros mecanismos entre ellos la formación de biofilms, flagelos y quimiotaxis. P. extremaustralis presentó un fenotipo de hiperflagelación y mayor formación de biofilms en condiciones de estrés oxidativo en concordancia con lo observado en los análisis globales. El análisis transcriptómico también permitió identificar y clasificar posibles pequeños RNA (sRNA) con expresión diferencial entre condiciones, que podrían tener funciones regulatorias relacionadas con la disponibilidad de O2 y el estrés oxidativo. Se validaron experimentalmente 8 de estos sRNA y uno de ellos, denominado sRNA40, fue analizado mediante experimentos de expresión pulsada seguidos de análisis transcriptómicos. Estos análisis permitieron identificar 19 genes con expresión diferencial en respuesta a la sobreexpresión de sRNA40 en microaerobiosis, relacionados con sistemas de transporte o de secreción que constituirían su blanco de acción. Por último, se analizó la respuesta a estrés nitrosativo inducido por nitrosoglutatión (GSNO) en microaerobiosis, donde la supervivencia luego de la exposición a GSNO fue menor que en aerobiosis. El análisis transcriptómico mostró incremento en la expresión de diversos genes como los relacionados con la producción y el transporte de pioverdinas, el metabolismo del hierro y la síntesis de proteínas, sugiriendo un alto turnover proteico probablemente relacionado con el efecto deletéreo del GSNO principalmente sobre proteínas que contienen hierro. También se verificó la activación del catabolismo del inositol, una vía poco estudiada en Pseudomonas, que aparece como una alternativa novedosa involucrada en la respuesta en presencia de estos compuestos. En conjunto, los resultados obtenidos muestran que en condiciones microaeróbicas P. extremaustralis despliega un conjunto de mecanismos fisiológicos, adicionales a enzimas detoxificantes, frente a agentes estresantes. Estos resultados contribuyen al conocimiento de la fisiología de P. extremaustralis frente al estrés oxidativo/nitrosativo en distintas condiciones de aireación. Algunos de los resultados obtenidos pueden extenderse a otras bacterias relacionadas y pueden ser de utilidad para aplicaciones biotecnológicas por su relevancia para la supervivencia de los organismos utilizados.
Reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS), produced in a wide range of physiological processes even under low oxygen availability, are among the main stressors found in the environment. Strategies developed to combat them constitute key features in bacterial adaptability and survival. Pseudomonas extremaustralis is a metabolic versatile and stress resistant Antarctic bacterium, able to grow under different oxygen conditions, making it a model of interest for the study of environmental adaptability. The present work explores the responses to oxidative and nitrosative stress in different aeration using global and physiological approaches. Under aerobic conditions we observed the activation of antioxidant defenses and low effect in different cellular parameters. In contrast, in microaeroiosis cells exhibited more oxidative damage in macromolecules and lower survival rates than under aerobiosis. Global studies (transcriptomic and proteomic) showed the use of traditional stress responses but also the overexpression of genes related to other mechanisms including the formation of biofilms and flagella. P. extremaustralis presented a phenotype of hyperflagelation and increased biofilm formation under conditions of oxidative stress in line with the global analysis results. Through transcriptomic analysis, we also identified and classified possible small RNAs (sRNA) with putative regulatory functions related to O2 availability and oxidative stress with differential expression between conditions. 8 of these sRNAs were experimentally validated and the role of one of them (sRNA40) was further analyzed using pulsed expression experiments followed by transcriptomic analysis. This approach allowed us to identify 19 genes with differential expression in response to the overexpression of sRNA40, the majority corresponding to transporters or secretion systems that would constitute their targets. Finally, we assessed the response to nitrosoglutathione (GSNO)-induced nitrosative stress. In microaerobiosis, survival after exposure to GSNO was lower than in aerobiosis. Transcriptomic analysis after GSNO exposure showed differential expression in various genes such as those related to the production and transport of pyoverdins, iron metabolism and protein synthesis, suggesting and increase in protein turnover. This could be related to the deleterious effect of GSNO on proteins that contain iron. The exposure to GSNO also caused the activation of inositol catabolism, a metabolic route that arises as a novel alternative pathway involved in the response to the presence of these compounds. Altogether, these results show that, under microaerobic conditions, P. extremaustralis displays a set of physiological mechanisms against stressors that could act in addition to well-known detoxifying enzymes and non-enzymatic mechanisms. The present work presents insights into P. extremaustralis ́ physiology in the response to oxidative and nitrosative stress, Due to the ecological and biotechnological importance of Pseudomonas spp. the understanding of the cellular and molecular mechanisms related to the adaptability to microaerobiosis and stress could be relevant for basic and applied knowledge.
Fil: Solar Venero, Esmeralda Clara. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.