Desarrollo y evaluación de nuevas formulaciones terapéuticas para la hepatitis C : rol del poloxámero F127 sobre la replicación viral y la resistencia antiviral mediada por proteín...

• Autores: Bernardi, Andrés
• Año de publicación: 2019
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de maestría
• Colaborador/a o director/a de tesis: Oubiña, José Raúl; Damonte, Elsa Beatriz; Ramanowski, Victor; Martinez Peralta, Liliana
• Materia: Hepatitis C; Poloxamero; F127; MRP4; Proteínas; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Bernardi, Andrés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argeentina
El virus hepatitis C (HCV por sus siglas en inglés) es una de las principales causas de hepatitis virales en el ser humano. Se estima que alrededor de 71 millones de personas en el mundo están\ninfectadas con el HCV. Alrededor de un 10-30% de las infecciones se resuelven en la etapa aguda,\nmientras que la mayoría de los individuos infectados desarrolla -en ausencia de un tratamiento eficaz- una infección crónica. Esta lesión persistente puede devenir en una cirrosis al cabo de 10\naños en un 5 ? 10 % de los pacientes. Eventualmente, algunos de estos pacientes cirróticos pueden\nprogresar al hepatocarcinoma (HCC) al cabo de aproximadamente otros 5 años de evolución.\nNo existe aún una vacuna para prevenir la infección por el HCV. Hasta 2014, la terapéutica\ncombinada de PEG-IFN (interferón pegilado) más ribavirina administrada por hasta 48 semanas era\nel tratamiento habitualmente instituido a nivel mundial, al que le sucedía una disímil respuesta del\nhuésped según el genotipo del HCV involucrado y la producción propia de IL-28B (IFN-?3) e IFN-\n?4. El surgimiento de antivirales de acción directa (AADs), dirigidos contra proteínas virales\nimprescindibles para la replicación del HCV, modificó en forma sustancial las estrategias\nterapéuticas contra este agente.\nLas proteínas ABC (ATP Binding Cassette transporters) integran una de las mayores y más antiguas\nfamilias de proteínas conocidas, habiéndose descripto miembros de esta familia en diversos\norganismos (desde bacterias hasta los seres humanos). Estas proteínas transportan una gran\nvariedad de sustratos (glúcidos, proteínas, iones metálicos, aminoácidos, lípidos, metabolitos, etc.)\na través de membranas intracelulares y también hacia el exterior de la célula. Durante muchos años\nse relacionó a dichas proteínas y a su actividad de bombas de eflujo, con la quimio-resistencia\nobservada en múltiples tumores. Un miembro de esta súper-familia de proteínas, MRP4 (ABCC4)\nes inducida compensatoriamente durante la colestasis. Además, niveles elevados de esta proteína\nhan sido detectados luego de la exposición a compuestos hepatotóxicos, lo cual sugiere que tendría\nuna función protectora para el hepatocito.\nContinuamente se están desarrollando nuevas estrategias para optimizar la terapéutica antiviral y\nantitumoral, dentro de las cuales, la nanotecnología ha adquirido una gran relevancia.\nRecientemente, se comenzó a evaluar -como posible estrategia- la formulación de compuestos\ndonde el principio activo esté acompañado de co-polímeros segmentados de poli (óxido de etileno)\n(PEO) y poli (óxido de propileno) (PPO), ya sea en forma de unímeros o como micelas poliméricas.\nDentro de la gran variedad de polímeros que se utilizan en la actualidad para aplicaciones\nbiomédicas, Pluronic® F127 es uno de los que más relevancia ha adquirido, debido a su amplia\nvariedad de posibles aplicaciones. Una de las más estudiadas de F127, es la modulación de las\nproteínas ABC, lo que lo hace muy atractivo como adyuvante en la formulación de fármacos\nantineoplásicos y antivirales.\nUno de los objetivos de la presente Tesis, fue estudiar el efecto de la expresión de diferentes\nproteínas del HCV sobre la expresión del ARN mensajero (ARNm) de mrp4 en líneas celulares de\nestirpe hepatocitaria. Como modelo experimental se utilizaron las líneas celulares Huh 7.5 SG -que\nmantiene en forma autónoma la replicación del ARN subgenómico del HCV y expresa sólo las\nproteínas no estructurales del virus-, y como control, la Huh 7.5 (células Huh 7 infectadas con el HCV y tratadas con interferón). Se pudo observar que en la línea celular Huh 7.5 SG, la expresión\nrelativa del ARNm de mrp4 es menor cuando se la compara con la expresión en Huh 7.5. Esto\npodría relacionarse con una menor capacidad de respuesta del hepatocito infectado por el HCV\npara la detoxificación frente a cuadros de colestasis. Una vez observada esta diferencia en el\nsistema experimental, se procedió a evaluar el efecto de las proteínas NS5A y Core del HCV sobre\nla actividad del promotor de mrp4 en la línea celular Huh 7.5. Ambas proteínas tienen diversos y numerosos efectos sobre distintas vías de señalización celular, como también en la inhibición/estimulación de la expresión de varias proteínas celulares. Mediante ensayos con el gen\nreportero luciferasa, se pudo determinar que tanto Core como NS5A, ejercen un efecto supresor sobre la actividad del promotor de mrp4. Este último resultado, es congruente con la menor expresión relativa del ARNm de mrp4 en Huh 7.5 SG.\nFinalmente, se determinó el efecto del poloxámero F127 sobre la replicación viral del HCV en Huh 7.5 SG, así como sobre la expresión del ARNm de mrp4 en las líneas celulares Huh 7.5 y Huh 7.5\nSG. En primer término, se observó una significativa disminución de la carga viral del HCV en el medio extracelular de los cultivos de Huh 7.5 SG tratados con F127 al 1%. Este efecto fue\ncomparable en magnitud a lo observado utilizando un antiviral de eficacia comprobada (Interferón\n?-pegilado). Sorprendentemente, dicho efecto no se tradujo en una modificación en los niveles de\nexpresión relativa del ARNm de mrp4, lo que sugeriría que la regulación negativa de la replicación viral ejercida por F127 (disminución de 0,5 ? 1 log UI ARN HCV / ml) fue insuficiente para revertir\nen los hepatocitos el efecto deletéreo promovido por el remanente de proteínas no-estructurales del\nHCV sobre el promotor de mrp4.\nEstos estudios iniciales desarrollados in vitro ponen de manifiesto un efecto supresor de las\nproteínas virales NS5A y Core sobre el promotor de mrp4 (no descripto previamente), lo que\nrepresenta una posible explicación mecanística respecto a la expresión relativa disminuida del\nARNm de mrp4 en Huh 7.5 SG. Además, el efecto antiviral de F127, constituye un muy promisorio\npunto de partida para estudiar formulaciones polímero-antiviral, evaluar su eficacia y compararla\ncon las de las AADs actualmente administradas como tratamiento de la hepatitis C crónica.
Magíster de la Universidad de Buenos Aires en Biología Molecular Médica