Propiedades antitumorales y mecanismo de acción in vitro e in vivo de un novedoso derivado sintético de penicilina

• Autores: Bellizzi, Yanina
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Blank, Viviana Claudia; Roguin, Leonor Patricia; Medina, Vanina; Fiszman, Gabriel; Zampini, Iris Catiana
• Materia: Melanoma; Triazolil Aminoacil Penicilinas; Apoptosis; Estrés del retículo endoplásmico; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Bellizzi, Yanina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
El melanoma es una forma invasiva y agresiva de cáncer de piel que se origina en las regiones más profundas de la epidermis. La incidencia mundial de esta enfermedad se encuentra en creciente aumento y a un ritmo más rápido en comparación con cualquier otro tipo de cáncer. Tal es así que, según datos recolectados en el periodo 2017-2019, se estima que en el año 2022 aproximadamente un 2.1 % de hombres y mujeres serán diagnosticados con melanoma en algún momento de su vida. El desarrollo del melanoma ocurre como consecuencia de la transformación maligna de los melanocitos, células productoras del pigmento melanina, producida por la radiación UV mediante dos mecanismos principales: la alteración directa de células que se convierten en neoplásicas luego de adquirir varias mutaciones (TP53, NF1, PTEN, etc.) o la transformación de los melanocitos en nevi benignos, que en el 80% de los casos albergan la mutación BRAF. A diferencia de otros tumores sólidos, el melanoma afecta principalmente a individuos jóvenes y de mediana edad al momento del diagnóstico. Asimismo, la mayoría de los melanomas suelen diagnosticarse en un estadio ya avanzado de la enfermedad, siendo los tumores irresecables o metastásicos (estadio IV). En esta instancia, la estrategia terapéutica de elección consiste en la utilización de dos tratamientos: inhibidores de tirosinas quinasas (por ejemplo, inhibidores de BRAF y MEK) e inmunoterapia, basada en la utilización de inhibidores de los puntos de control del sistema inmunitario (anticuerpos monoclonales anti-CTLA4 y anti-PD1). Si bien estos avances terapéuticos han mejorado significativamente el tratamiento de esta enfermedad, la falta de respuesta (resistencia) al tratamiento observada en algunos pacientes y la aparición de efectos adversos que afectan la calidad de vida de los mismos continúan siendo temas a resolver.\nSobre la base de estos antecedentes, desarrollamos un proyecto de investigación que consistió en identificar y caracterizar el mecanismo de acción de nuevos compuestos líderes para el desarrollo de agentes antitumorales de eficacia terapéutica. En este sentido, el diseño racional y la síntesis química de compuestos híbridos constituyen una estrategia utilizada en el descubrimiento de nuevos fármacos. La hibridación molecular involucra la obtención de nuevas entidades químicas mediante la fusión (generalmente a través de una unión covalente) de dos compuestos activos o bien de reconocidas unidades farmacofóricas que derivan de moléculas bioactivas conocidas. El objetivo de esta unión es la obtención de un compuesto híbrido que posea una mejorada afinidad y eficacia comparada con las drogas que le dieron origen. A este respecto, en un trabajo previo realizado en nuestro laboratorio, se evaluó la actividad antiproliferativa de una biblioteca de compuestos híbridos derivados de penicilinas (Triazolil Aminoacil Penicilinas: TAPs) sobre el crecimiento de dos líneas de células tumorales y de una línea no neoplásica. Uno de estos derivados, denominado TAP7f, resultó ser no solo un agente antiproliferativo potente, sino que además inhibió selectivamente el crecimiento de las células tumorales con respecto a las no neoplásicas. Sobre la base de este hallazgo, nuestra hipótesis de trabajo consistió en estudiar la actividad antitumoral de una biblioteca más amplia de derivados sintéticos de penicilina con variaciones estructurales de diversa naturaleza. Así, se sintetizaron: veintinueve Oxadiazolil Aminoacil Penicilinas (OAPs), conformados por una porción penicilánica unida a una porción peptídica a través de un anillo oxadiazol (1,2,4 o 1,3,4-sustituido), siete nuevos TAPs, que presentan en su estructura una penicilina unida a una porción peptídica vía un anillo triazol, y doce Triazolil Peptoidil Penicilinas (TPPs) contituidos por un nucleo penicilánico unido a un residuo peptoide a través de un anillo triazol. Luego, se determinaron los valores de IC50 de los derivados en una línea de melanoma murino (B16-F0) y en una línea no neoplásica (NMuMG), utilizada como control. Sobre la base de los resultados obtenidos, se seleccionó el TAP7f para continuar con nuestros estudios debido a que, entre todos los derivados ensayados, resultó ser el que exhibió la mayor potencia y selectividad antineoplásica en las células tumorales evaluadas. Posteriormente, estudiamos el efecto antitumoral del TAP7f en un panel más amplio de líneas celulares neoplásicas, tanto humanas (leucemia promielocítica aguda, HL60; carcinoma nasofaríngeo, KB; adenocarcinoma de próstata, PC3; carcinoma mamario, MCF-7; leucemia de células T aguda, Jurkat; adecarcinoma colorrectal, HT-29; fibrosarcoma, HT-1080 y SK-MEL 28, WM35, A375 y M1/15, melanoma maligno) como murinas (melanoma, B16-F0; adenocarcinoma mamario, LM3 y carcinoma colorrectal, CT-26), así como también en células no tumorales (epitelio mamario murino normal, NMuMG y fibroblastos de embrión de ratón, NIH-3T3). Particularmente, las células de melanoma murino B16-F0 fueron aquellas en las que el TAP7f exhibió la mayor potencia (IC50 = 3±1) y selectividad antineoplásica (?30 veces).\nCon la finalidad de caracterizar los mecanismos moleculares que conducen a la muerte celular, evaluamos la eficacia del TAP7f en modelos de melanoma in vitro e in vivo. Como modelo in vitro se utilizaron células B16-F0 de melanoma murino, y a fines comparativos, algunos experimentos se realizaron con células A375 de melanoma humano. Cuando estudiamos el mecanismo de muerte promovido por el TAP7f en las células de melanoma, demostramos que la inhibición de la vía ERK 1/2 y la activación de las MAPKs p38 y JNK, y de la vía PI3K/Akt favorecen la inducción de una respuesta apoptótica. Además, evidenciamos la participación de la vía extrínseca de la apoptosis caracterizada por la sobre-expresión del ligando TRAIL, del receptor de muerte Fas, y la consecuente activación de la caspasa 8. Por otro lado, el desbalance en los niveles de expresión de proteínas de la familia Bcl-2 a favor de los miembros pro-apoptóticos, y la posterior activación de la caspasa 9 demostraron la participación de la vía mitocondrial. La convergente activación de la caspasa 3 favoreció el clivaje de PARP-1 y la muerte celular por apoptosis. También observamos que el derivado produjo estrés del retículo endoplásmico (RE) evidenciado por un aumento en los niveles de expresión de proteínas marcadoras, tales como GADD153/CHOP, ATF4, Bip y Calnexina. Adicionalmente, verificamos que la activación de las MAPKs p38 y JNK, y de la vía PI3K/Akt ocurren rio abajo de la inducción del estrés del RE. Asimismo, demostramos la inhibición de una respuesta autofágica (mediada por la vía PI3K/Akt) tendiente a contrarrestar el efecto citotóxico del TAP7f y el arresto en la fase S del ciclo celular. Sobre la base de los resultados obtenidos, y teniendo en cuenta los beneficios sustanciales de las terapias combinadas, decidimos evaluar el efecto in vitro de la combinación del TAP7f con un conocido activador del estrés del RE, la Tapsigargina. Tanto en la línea de melanoma murino (B16-F0) como en la humana (A375), la administración simultánea de distintas concentraciones de ambos compuestos resultó en un notorio efecto sinérgico, caracterizado por la obtención de índices de combinación (IC) menores a uno.\nFinalmente, demostramos el efecto antitumoral in vivo del TAP7f en el modelo singénico de melanoma murino B16-F0. En primer lugar, observamos que la administración de 10 y 20 mg/kg del TAP7f produjo una reducción del volumen tumoral del 50 y 70 % respectivamente, así como un incremento de áreas histológicamente necróticas en los tumores de ratones tratados con las dosis mencionadas. En aquellas condiciones en las cuales se realizó el tratamiento con 20 mg/kg de TAP7f, se verificó una disminución en los niveles de expresión del antígeno de proliferación nuclear (PCNA), la activación de una respuesta de estrés del RE y la inducción de apoptosis como mecanismo de muerte celular. Posteriormente, estudiamos el efecto combinado in vivo resultante de la co-administración de una dosis de 4 mg/kg (cinco veces menor a la máxima ensayada) del TAP7f y de 0,3 mg/kg de la Tapsigargina (dosis que produce un 17% de inhibición del crecimiento tumoral). Llamativamente, se evidenció una disminución del crecimiento tumoral del 50% luego de la administración de la combinación de ambas drogas, dejando de manifiesto un marcado efecto sinérgico. Asimismo, la utilización de dosis sub-optimas de los dos compuestos no generó toxicidad sistémica en tejidos fisiológicamente relevantes. Con respecto al mecanismo de acción de la co-administración de TAP7f y Tapsigargina, demostramos que la combinación produjo un aumento en los niveles de proteínas pro apoptóticas tales como caspasa 3 activa, PARP-1 clivado y Bax. Asimismo, se observó que la administración simultánea de ambos agentes desencadenó un mecanismo apoptótico de muerte celular vía estrés del RE.\nEn su conjunto, los resultados obtenidos indicaron que el TAP7f resultó un tratamiento eficaz para el tratamiento del melanoma, tanto en modelos in vitro (B16-F0 y A375) como in vivo (ratones C57BL/6J). La caracterización realizada de los eventos moleculares que condujeron a una respuesta de estrés del RE seguida de muerte celular por apoptosis, nos llevaron a desarrollar una terapia combinada que potenció sinérgicamente la respuesta el tratamiento. En conclusión, estos hallazgos nos llevan a postular al TAP7f como un novedoso agente antitumoral de potencial interés terapéutico que podría ser utilizado en ensayos clínicos dirigidos a combatir de manera más eficiente una de las enfermedades malignas con mayor grado de letalidad, como es el melanoma
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Biológicas