Estudio de inmunización intranasal con antígenos de Brucella para potencial desarrollo de vacunas acelulares para Brucelosis

• Autores: Muñoz Gonzalez, Florencia
• Año de publicación: 2020
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Ferrero, Mariana; Flichman, Diego; Cerquetti, Cristina; Docena, Guillermo
• Materia: Brucelosis; Vacunas; Mucosas; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Muñoz Gonzalez, Florencia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
La brucelosis es una enfermedad zoonótica, causada por bacterias del género Brucella, frecuentemente adquirida por ingestión, inhalación, salpicadura conjuntival o contacto de la piel lesionada con productos de animales infectados. Dentro de este género B. abortus, B. melitensis y B. suis son las de mayor patogenicidad para el hombre. La enfermedad humana representa una causa importante de morbilidad en todo el mundo, mientras que la brucelosis animal se asocia con graves pérdidas económicas causadas principalmente por aborto e infertilidad. La incidencia de la brucelosis humana y animal es elevada en nuestro país debido a la intensa actividad ganadera y la industria láctea y cárnica. El ingreso por mucosas es la forma principal de contagio entre los animales susceptibles. Cabe destacar que no existen vacunas para la brucelosis humana ni para la enfermedad porcina (causada por B. suis). Actualmente las vacunas aprobadas para el ganado bovino, caprino y ovino se basan en cepas vivas atenuadas que no son totalmente efectivas y poseen ciertas desventajas: 1) generan una respuesta inmune que impide el diagnóstico diferencial entre animales infectados y vacunados; 2) pueden enfermar al hombre; y 3) generan abortos en animales gestantes. Aunque las mucosas constituyen la principal puerta de entrada de Brucella, la mayoría de las vacunas aprobadas se administran por vía parenteral y son pobres inductoras de inmunidad de mucosas. En cambio, las vacunas administradas por mucosas pueden inducir respuestas inmunes humorales y celulares sistémicas y en mucosas. A este atributo se le suma el atractivo de una inmunización no invasiva (sin agujas). El objetivo general de esta tesis fue desarrollar vacunas acelulares que al ser administradas por vía intranasal (i.n.) generen una respuesta inmune capaz de proteger al individuo contra la infección por Brucella spp. adquirida por mucosas. La inmunización i.n. con la proteína recombinante VirB7 del SST4 de B. abortus junto con la toxina colérica, como adyuvante de mucosa, generó una respuesta inmune humoral específica tanto sistémica como de mucosas y una respuesta inmune celular específica. Por el contrario, la administración i.n. de VirB7 junto con la proteína adyuvante U-Omp16 de B. abortus no indujo una respuesta inmune humoral pero sí una respuesta celular específica detectada únicamente in vitro. La inmunización i.n. con VirB7+TC y VirB7+U-Omp16 no logró proteger frente al desafío por mucosas con B. abortus. En el segundo capítulo de esta tesis, nos enfocamos en desarrollar una vacuna acelular para proteger de la infección causada por B. suis. Para ello estudiamos el potencial de la adhesina BtaF de B. suis como antígeno vacunal. Para evaluar el rol de la adhesina BtaF durante la infección respiratoria establecimos un modelo murino de infección intratraqueal con B. suis y caracterizamos la cinética de infección y diseminación. Demostramos que B. suis podría replicar en el pulmón durante la primera semana p.i. y diseminarse tempranamente desde el sitio de entrada. Empleando una cepa de B. suis con una deleción en el gen que codifica para la adhesina BtaF demostramos que esta proteína es necesaria para una completa virulencia de B. suis durante la infección intratraqueal. La inmunización i.n. con BtaF más el adyuvante de mucosas c-di-AMP indujo una respuesta inmune humoral específica tanto en mucosas como a nivel sistémico. Los anticuerpos contra BtaF presentes en el suero de ratones inmunizados redujeron la adhesión de B. suis a las células epiteliales alveolares humanas (A549) y a fetuina, rica en ácido siálico, y promovieron la fagocitosis de B. suis por macrófagos murinos. Sumado a esto, la vacunación i.n. con BtaF indujo una respuesta inmune celular mixta Th1/Th2/Th17, con producción de IFN-? dependiente de LT CD4+ tanto en pulmón como en bazo, y células CD4+ de memoria central específicas en los ganglios linfáticos cervicales. La vacunación con BtaF protegió eficientemente de la infección intragástrica con B. suis, aunque no logró proteger frente a la infección respiratoria. En un enfoque diferente para el diseño de vacunas acelulares, en el tercer capítulo de esta Tesis evaluamos la protección conferida por la inmunización con vesículas de membrana externa (VME) de B. suis. Obtuvimos VME producidas por excreción/secreción de B. suis M1330 (VME wt) y de la cepa mutante atenuada B. suis ?mapB (VME ?mapB) en medio GW suplementado con 1% extracto de levadura. La inmunización intramuscular (i.m.) con VME wt tanto en presencia como en ausencia de un adyuvante indujo una respuesta inmune humoral específica, lo que demostró que estas VME son inmunogénicas y auto-adyuvantes. Para comenzar a dilucidar los mecanismos implicados en la capacidad inmunoestimulante de estas vesículas evaluamos su capacidad para activar el inflamasoma empleando la línea celular reportera THP1-ASC-GFP. Demostramos que las VME wt activan inflamasomas dependientes de ASC y promueven la secreción de IL-1?. Por otro lado, la inmunización i.m. con VME wt y VME ?mapB redujo la carga esplénica de B. suis, luego de la infección i.p., y la carga pulmonar y esplénica luego de la infección respiratoria. Aunque la inmunización con VME ?mapB logró mayor nivel de protección frente al desafío sistémico que la inmunización con VME wt, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. En conjunto, los resultados de esta tesis nos permiten concluir que la vacunación i.n. con antígenos solubles como VriB7 y BtaF junto a adyuvantes de mucosa no logra una respuesta inmune suficiente para proteger contra la brucelosis adquirida por vía respiratoria, sin embargo, en el caso de BtaF sí protegería de la infección por otras mucosas como la gástrica. Por el contrario, la vacunación i.m. con VME protege contra la infección sistémica con B. suis y controla parcialmente la infección respiratoria. Este es el primer trabajo en demostrar el potencial inmunogénico y protectivo de adhesinas de Brucella como vacunas mucosales y en evaluar la capacidad de vacunas basadas en VME de B. suis para proteger de la infección sistémica y por mucosas.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias de la Salud