Interacción del virus Junín con el citoesqueleto y la membrana de la célula huésped

• Autores: Cordo, Sandra Myriam
• Año de publicación: 2004
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Candurra, Nélida Alicia
• Materia: VIRUS JUNIN; FILAMENTOS INTERMEDIOS; FRACCIONAMIENTO CELULAR; MICRODOMINIOS DE MEMBRANA
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

EI virus Junín (JUNV), agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina, esun miembro de la familia Arenaviridae. Es un virus envuelto de genoma ARNsegmentado cuyo ciclo de replicación ha sido caracterizado en varios aspectos. Laentrada a las células blanco se realiza vía endocitosis mediada por receptor y posteriorfusión dependiente de PH. Una vez que la nucleocápside se encuentra dentro delcitoplasma se expresan 5 proteínas estructurales, mediante una estrategia decodificación ambisense. La proteína mayoritaria asociada a la nucleocápside esdenominada NP. A partir de un único precursor glicoproteico (GPC), sintetizado en elretículo y exportado a la membrana plasmática de la célula, se obtienen dosglicoproteínas virales denominadas GP1 y GP2. Ambas conforman las estructurasclaviformes encontradas en la envoltura viral. Se desconocen hasta el momento losmecanismos detallados y las estructuras celulares involucradas en el transporte de lasdistintas proteínas virales hacia el sitio de brotación. El ensamblado de las partículasvirales se lleva a cabo en la membrana plasmática de las células infectadas. En este trabajo se estudiaron algunos aspectos de la interacción virus-célulahuésped, caracterizando la asociación de NP, GPC y GP1 a distintas estructurascelulares. En primer lugar se estudió la interacción del virus con la red de filamentosintermedios (FI) del citoesqueleto. Se utilizó el compuesto acrilamida capaz dedesorganizar específicamente los FI. La producción de virus infeccioso disminuyó demanera dosis-dependiente en presencia del mismo. Los resultados, observados encelulas Vero, cultivos de fibroblastos humanos y astrocitos murinos, fueroncomparables. Se analizó luego el efecto del compuesto sobre diferentes pasos delciclo de multiplicación. De esta manera se determinó que la integridad de los FI escrucial al menos durante los pasos previos a la síntesis de proteínas virales yposteriores a la internalización. Mediante extracciones específicas realizadas condetergentes no iónicos se encontró que NP se asocia a la fracción celularcorrespondiente al citoesqueleto, aunque no se determinó a que componentecorrespondería esta interacción. Las glicoproteínas no mostraron asociación específicaa estas fracciones celulares en iguales condiciones. Por otro lado, modificaciones en el contenido de colesterol de las célulasinfectadas y tratadas con inhibidores de la enzima HMG-CoA reductasa, disminuyeronla infectividad y localización de las glicoproteinas en la membrana de las mismas. Estos resultados llevaron al análisis de la asociación de GPC y GP1 a estructuras demembrana ricas en colesterol denominadas rafts. Los ensayos de fraccionamientocelular específicos para estos microdominios de membrana mostraron la localizaciónde las glicoproteínas en rafts. Esta interacción fue dependiente de la temperatura y dela presencia de colesterol en los cultivos infectados. Además, la asociación de lasglicoproteínas a las fracciones rafts fue estabilizada a 37°C por la adición deanticuerpos específicos. Estos resultados sugieren la utilización de esta vía comomecanismo de transporte para GPC y GP1 a la membrana celular de las célulasinfectadas. Asimismo la localización de las glicoproteínas en los microdominios raftspodría representar una estrategia para el reclutamiento de los componentes viralesprevio al paso de liberación de la progenie en las células infectadas.
Junin virus (JUNV), the etiological agent of argentine hemorrhagic fever, is amember of the Arenaviridae family. The viral cycle multiplication of this RNA virus hasbeen characterized in different aspects. The entrance in the target cells is performed byreceptor-mediated endocytosis following pH dependant fusion step. Once thenucleocapsids are within the cytoplasm the ambisense strategy allows expression offive structural proteins. The major nucleocapsid associated protein is named NP. As aresult of the glycoprotein precursor synthesis and after its maturation and exocytictransport to plasma membrane of infected cells, two glycoproteins are obtained. Bothproteins, named GP1 and GP2, form the claviform structures found in the viralenvelope. At this moment, the detailed mechanisms and cellular structures involved inthe transport of different viral proteins towards the budding site are not known althoughthe fact that viral assembly is carried out in plasma membrane of infected cells iscurrently accepted. In this work we have studied some aspects of virus-cell interactioncharacterizing the association of NP, GPC y GP1 to cellular structures. First, we havestudied the interaction between virus and cytoskeletal intermediate filaments (IF). In thepresence of acrylamide, compound that selectively disrupt IF, viral yield wasdiminished. The results were similar in Vero cells, human fibroblast cultures and murineastrocytes. Then, we analyzed the effect of acrylamide on different steps of themultiplication cycle. It was determined that IF integrity is essential at least between thestep of internalization and viral protein synthesis. Detergent extractions of infectedcultures demonstrated that NP associates to cellular cytoskeletal fraction although itwas not possible to identify the specific cytoskeletal framework involved in thatassociation. Glycoproteins did not show specific association to these cytoskeletalfractions under similar conditions assayed. On the other hand, modifications in the cholesterol contents of infected cellsinduced by HMG-CoA reductase inhibitors, diminished infectivity and glycoproteinsmembrane localization. This result leded us to analyse the association of GPC and GP1 to membrane cholesterol enriched structures named rafts. Specific cellularfractionation assays showed glycoproteins associated to raft microdomains. Thisinteraction was temperature and cholesterol dependant. Moreover, glycoprotein association to membrane rafts was stabilized at 37°C by specific antibody addition. These results suggest that GPC and GP1 may utilize the exocytic raft pathway to reachthe plasma membrane of infected cells. Finally, glycoproteins raft association mayrepresent the strategy to recruit viral proteins before releasing progeny from the cells.
Fil: Cordo, Sandra Myriam. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.