Mecánica y dinámica del citoesqueleto en células vivas

• Autores: Pallavicini, Carla
• Año de publicación: 2017
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Bruno, Luciana; Levi, Valeria
• Materia: CITOESQUELETO; MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA; MICROTÚBULOS; TRACKING DE FILAMENTOS; BUCKLING DE FILAMENTOS; CANCER DE PROSTATA; CYTOSKELETON; FLUORESCENCE MICROSCOPY; MICROTUBULES; FILAMENT TRACKING; FILAMENT BUCKLING; PROSTATE CANCER
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El citoesqueleto es una red auto-organizada y dinámica presente en las célulaseucariotas. Está compuesto por tres tipos de biopolímeros: filamentos de actina,filamentos intermedios y microtúbulos. Estos filamentos se constituyen a partir dela polimerización de proteínas más simples y forman estructuras con diámetros de ~6nm para los filamentos de actina y ~10nm para los filamentos intermedios. Losmicrotúbulos son los elementos más rígidos del citoesqueleto, con una estructuratubular de diámetro externo de ~25nm. Estos biopolímeros, en conjunto con proteínas motoras, componen un entramado con propiedades mecánicas que permite alas células generar y reaccionar ante la acción de fuerzas. El citoesqueleto está involucrado en numerosos procesos celulares tales como lamigración, división, contracción y el transporte de organelas. Por este motivo es muy importante estudiar el comportamiento mecánico de los filamentos del citoesqueleto para lograr un mayor conocimiento de la organización y mecánica celular. La microscopía de fluorescencia ha revolucionado nuestro conocimiento del citoesqueleto, permitiendo su visualización en células vivas. El análisis del movimiento y de las fluctuaciones en las formas de los filamentos del citoesqueleto permite estudiar las propiedades mecánicas relevantes a su función biológica. Este tipo de análisis requiere la identificación de las posiciones de filamentos individuales con alta precisión. Sin embargo, el seguimiento de filamentos individuales a partir de imágenes de microscopía de fluorescencia de células vivas es extremadamente complejo. Es por ello que en la primera parte de esta Tesis, desarrollamos un algoritmode tracking de filamentos que permite obtener las coordenadas de microtúbulosfluorescentes con precisión subdifracción. Evaluamos el rendimiento de esta rutinamediante simulaciones numéricas de imágenes confocales y experimentos in vitro yobtuvimos una precisión de ~9nm para filamentos in vitro y ~20nm para filamentosen células fijadas. Utilizando este algoritmo, estudiamos las distribuciones de curvaturas de microtúbulos en células melanóforas de Xenopus laevis vivas. Mediante un análisis de Fourier de las formas de los filamentos hallamos que, en un entorno fuera del equilibrio como el citoplasma, las curvaturas se ajustaban a un comportamiento térmico, de acuerdo con resultados reportados anteriormente. Estos datos fueron utilizados para calcular la longitud de persistencia de los microtúbulos en distintas condiciones experimentales. La longitud de persistencia es un parámetro ampliamente utilizado para describir las propiedades mecánicas de filamentos, y se define como la razón entre la rigidez exural del filamento y las fuerzas térmicas actuando sobre el mismo. La longitud de persistencia efectiva calculada para microtúbulos en células vivas fue ~20 nm, valor significativamente menor que el medido in vitro. Este parámetro no se vio modificado en presencia de la proteína asociada a microtúbulos XTP o la depolimerización de actina. En contraste, la depolimerización de la red de filamentos intermedios disminuyó significativamente el valor de este parámetro. Por otra parte, exploramos si la inhibición de los eventos de polimerización y depolimerización de los microtúbulos podría afectar su rigidez exural efectiva. En este caso, la distribución de formas de los filamentos no se ajustó a un comportamiento térmico, como el observado en células control, indicando que el comportamiento mecánico de los microtúbulos depende de un delicado equilibrio de fuerzas activas dentro de la célula. Observamos que la depolimerización de filamentos de actina e intermedios aumentasignificativamente las fluctuaciones laterales de los microtúbulos, sugiriendoque estos filamentos contribuyen a la organización global de dicha red. Por otra parte, verificamos que la producción de fuerzas no es homogénea dentro de las células ya que los microtúbulos presentaban un movimiento más lento, pero más direccionado en la región cortical en comparación con la región perinuclear. En la segunda parte de esta Tesis, estudiamos los aspectos dinámicos de loseventos de buckling de microtúbulos en células melanóforas de Xenopus laevis. Éstosson eventos transitorios y localizados observados frecuentemente en células, y secaracteriza por una rápida exión del filamento seguida de su relajación. Se hapropuesto que estos eventos de rápida deformación dependen de fuerzas localizadasespacio-temporalmente resultantes de la acción de motores moleculares. Para comprender este fenómeno, caracterizamos los eventos de buckling medianteel tracking de microtúbulos fluorescentes individuales en combinación con simulaciones numéricas, las cuales nos permitieron explorar distintos mecanismos que podrían producir la exión de filamentos. Los eventos simulados reprodujeron muchas de las características observadas en microtúbulos en células vivas, sugiriendo que el modelo mecánico implementado representaba los procesos esenciales del buckling de microtúbulos. Luego analizamos la interacción entre vesículas fluorescentes transportadas activamente y la red de microtúbulos pudiendo así observar eventos generados por fuerzas activas y correlacionarlos con el movimiento de las vesículas. Los resultados obtenidos de este análisis sugieren que los microtúbulos podríanafectar el transporte indirectamente, aparte de servir como vías para las organelastransportadas. Con el fin de extender nuestro análisis del citoesqueleto a otros sistemas biológicos, estudiamos células de cáncer de próstata, que muestran una expresión anormal de proteínas del citoesqueleto, resultando en una resistencia a la quimioterapia y capacidad de colonizar órganos lejanos. Desarrollamos técnicas computacionales para analizar imágenes de fluorescencia de citoesqueleto en estas células y, en particular, cuantificar la acción de una droga que induce la expresión de Hemo oxigenasa-1, una enzima implicada en la regulación de la morfología celular. Nuestros resultados mostraron que la células bajo la inducción de HO-1 presentaban menos migración y una proporción significativamente mayor de protrusiones tipo-filopodias que las células control, los que indicaría una mayor comunicación entre células vecinas. En síntesis, llevamos a cabo experimentos biológicos para observar el citoesqueletoy desarrollamos técnicas que nos permitieron estudiar estos filamentos en célulasvivas. De esta forma, pudimos analizar cuantitativamente la importancia del balancey dinámica de fuerzas activas en células para la organización de la red de microtúbulos. Estos conocimientos también fueron de utilidad para analizar los cambios en elcitoesqueleto de células de cáncer de próstata.
Eukaryotic cells contain a cytoskeleton; a self-organized and highly dynamicnetwork, which consists of three main types of protein filaments: microtubules, intermediate filaments and actin filaments. Actin filaments present a cable-like structure, with a diameter of ~6nm and intermediate filaments have a rope-like structure, with a diameter of ~10nm. The stiffest elements of cytoskeleton are microtubules, pipe-like structures with an outer diameter of ~25nm. Cells both actively generate and sensitively react to forces through the mechanical framework composed by these biopolymers and motor proteins. The cytoskeleton is involved in numerous cellular processes such as migration,division, and contraction and provides the tracks for transport driven by molecularmotors. Therefore, it is very important to quantify the mechanical behavior of thecytoskeletal filaments to get a better insight into cell mechanics and organization. Fluorescence microscopy has revolutionized our understanding of the cytoskeletonby allowing the visualization of these filaments in living cells. It has beendemonstrated that relevant mechanical properties of microtubules can be extractedfrom the analysis of their motion and shape fluctuations. These analyses requireidentifying with high spatial precision the localization of single microtubules. However, tracking individual filaments from fluorescence microscopy images of living cells is extremely complex. The existing filament tracking routines so far, require high signal to noise ratios and homogeneous backgrounds. In the first part of this Thesis, we developed a new filament tracking algorithmthat allows recovering the coordinates of fluorescent microtubules. We evaluated the performance of this algorithm through computational simulations and in vitro experiments and found that its precision is ~9nm and 20nm in vitro and in fixedcells, respectively. Using this algorithm, we studied the distributions of curvatures of fluorescent microtubules in living Xenopus laevis melanophore cells. By performing a Fourier analysis of the microtubule shapes, we found that the curvatures in a non-thermal environment as the cytoplasm followed a thermal-like distribution, as previously reported. These data were used to calculate microtubule persistence length (lp) in different experimental conditions. The persistence length is a widely used parameter to describe filament mechanical properties, it is determined by the ratio of the exural rigidity of the filament with the thermal forces acting upon it. The effective lp of microtubules in living cells was ~20nm, i.e. significantly smaller than that measured in vitro. In addition, we found that the microtubule-associated protein XTP or the depolymerization of the actin network did not affect the effective lp. In contrast, the depolymerization of the intermediate filaments network decreased the effective persistence length. We also explored whether inhibiting the microtubule polymerization/depolymerizationevents affects the effective exural rigidity. We found that microtubule shapes donot follow the thermal-like behavior observed in control cells, implying that thisbehavior depends on a delicate balance of active forces within the cell. We also explore the influence of actin and intermediate filaments on the motionof microtubules and observed that the depolymerization of these filaments signifi-cantly increased microtubule motion, suggesting that these filaments contribute tothe overall organization of the microtubule network. Moreover, the analysis of trajectories of microtubule segments in control cells showed that these filaments presented a slower but more directional motion in the cortex with respect to the perinuclear region. In the second part of this Thesis, we studied dynamical aspects of microtubulebuckling using Xenopus laevis melanophores as a model system. Microtubulebuckling is a transient and localized event commonly observed in living cells andcharacterized by a fast bending of the filament followed by its relaxation. It has been proposed that these rapid deformations depend on active forces resulting from the action of molecular motors. We characterize these buckling events by tracking single fluorescent microtubulesfrom confocal movies with high temporal resolution (0.3{2 s). We recovered the center coordinates of the filaments with 10-20 nm precision and analyzed the amplitude of the deformation as a function of time. Using numerical simulations, we explored different force mechanisms resulting infilament bending. The simulated events reproduced many features observed for microtubules in living cells, suggesting that a mechanistic model captured the essential processes underlying microtubule buckling. Also, we studied the interplay between actively transported vesicles and themicrotubule network using a two-color technique. This minimally invasive techniqueallowed the observation of force driven events and their correlation with the vesicles motion. The results suggested that microtubules may affect transport indirectly in addition to serving as tracks of motor-driven organelles. In an attempt to extend this analysis to other biological systems we focused onprostate cancer cells that display abnormal expression of cytoskeletal proteins resulting in an augmented capacity to resist chemotherapy and colonize distant organs. We developed computational tools to analyze fluorescence images of the cytoskeletonin prostate cancer cells, and found that under Heme oxygenase 1 (HO-1) induction (HO-1 is implicated in the regulation of cell morphology) these cells presented asignificant higher proportion of filopodia-like protrusions favoring zippering among neighboring cells. Overall, we performed biological experiments in order to observe the cytoskeletondeveloped techniques that allowed us to study these filaments in living cells. Withthis, we were able to analyze quantitatively the importance of the balance anddynamics of active forces within living cells on microtubule network organization. These tools were useful to asses cytoskeletal modifications in prostate cancer cells.
Fil: Pallavicini, Carla. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.