Complementación de baculovirus que no forman cuerpos de oclusión mediante líneas celulares establemente transformadas con el gen poliedrina

• Autores: López, María Gabriela; Taboga, Oscar
• Año de publicación: 2010
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Taboga, Oscar
• Materia: BACULOVIRUS; POLIEDRINA; LINEA ESTABLE; COMPLEMENTACION OCC; LARVAS DE LEPIDOPTERO; BACULOVIRUS; POLYHEDRIN; STABLE LINE; OCC-COMPLEMENTATION; LEPIDOPTERA LARVAE
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Los baculovirus son un grupo diverso de virus que infectan artrópodos. AcMNPV presenta un ciclo de vida bifásico, con dos fenotipos virales: los virus brotantes y los virus derivados de los cuerpos de oclusión (ODV). Los ODV, responsables de la infección primaria, se embeben en una matriz de poliedrina, proteína que no es esencial para la propagación de los virus en cultivos celulares. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo desarrollar una línea transformada de insecto empaquetadora de baculovirus defectivos en poliedrina, bajo la hipótesis de que es posible complementar esta deficiencia en trans desde el genoma celular. Para ello, en primer lugar, se evaluaron diferentes secuencias regulatorias del promotor del gen poliedrina controlando el gen reportero CAT, en ensayos de transfección transitoria. Luego de la infección con un baculovirus occ-, los mayores niveles de actividad reportera se obtuvieron con una región regulatoria de 2.735 pb que incluye el promotor mínimo de poliedrina y secuencias con funciones de enhancer de la transcripción en baculovirus (hr1, AcSp). Esta región fue seleccionada para regular la transcripción de poliedrina en las líneas establemente transformadas. La infección de una de estas líneas, Sf9POL, demostró que la morfogénesis de poliedros ocurre de manera similar a la de la infección natural y los baculovirus resultantes mostraron además una infectividad similar a los salvajes, en larvas de Rachiplusia nu. Las larvas infectadas oralmente mostraron sólo una progenie viral de genotipo pol- y fenotipo occ-, incapaz de propagar la infección por vías naturales. Colateralmente, se describe una mutación en la posición 130 del gen poliedrina, responsable de alteraciones en tamaño, morfología y capacidad de oclusión de poliedros. En conjunto, los resultados y conclusiones de este trabajo contribuyen al conocimiento de los mecanismos de morfogénesis de los cuerpos de oclusión en el baculovirus AcMNPV, con importantes implicancias en el diseño de baculovirus recombinantes para el control de plagas y la producción de proteínas recombinantes en larvas de lepidópteros.
Baculovirus is a diverse family of virus infecting arthropoda. AcMNPV has a bifasic life cycle, with two viral phenotypes: budded virus and occlusion-derived virus (ODV). ODVs are responsible of primary infection and occlude into a polyhedrin matrix to form polyhedra. Polyhedrin is a non- essential protein for multiplication in cell cultures. The main goal of this work was to develop a transformed insect cell line for packaging polyhedrin defective virus, hypothesizing that it is possible to complement this deletion in trans from the cellular genome. In this way, different polh gene regulatory sequences driving CAT were evaluated by reporter gene assays. After infection of transiently transformed insect cells with pol- baculovirus, the highest CAT levels were obteined when a 2,735 bp regulatory region containing the minimum polyhedrin promoter preceded by hr1 and AcSp sequences with known enhancer activities, was positioned upstream CAT gene. This region was selected to regulate the transcription of polyhedrin in stably transformed cell lines. The infection of one line named Sf9POL demonstrated that morphogenesis of polyhedra occurred in a similar way to the natural infection and that rendered baculovirus also showed similar infectivity for Rachiplusia nu larvae. Oral infection of larvae with polyhedra from infection of Sf9POL line, generated a viral progeny genotypically pol- and phenotypically occ-, unable to propagate the infection by natural means. Colaterally, a mutation in the polyhedrin gene mapped in the position 130 and responsible for alterations in size, shape and capacity for virion occlusion, is described. Together, results and conclusions presented here contribute to the knowledge of the morphogenesis of occlusion bodies in AcMNPV, with important implicances in the design of recombinant baculovirus for plague control and production of heterologous proteins in lepidoptera larvae.
Fil: López, María Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
Fil: Taboga, Oscar. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.