Estudio de la interacción de glucocorticoides, citoquinas y factores de transcripción en la regulación del fenotipo del linfocito T de ayuda

• Autores: Liberman, Ana Clara
• Año de publicación: 2007
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Arzt, Eduardo Simón
• Materia: GR; T-BET; GATA-3; INMUNOSUPRESION; DIFERENCIACION TH; GR; T-BET; GATA-3; IMMUNOSSUPRESSION; TH DIFFERENTIATION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La acción antiinflamatoria e inmunosupresora de los glucocorticoides (GC) involucra la regulación de la actividad de varios factores de transcripción (FT) como ser NF-kB, AP-1, NFAT y miembros de la familia STAT. Los FT T-bet y GATA-3 son claves para la adquisición del fenotipo T de ayuda 1 (Th1) y T de ayuda 2 (Th2) respectivamente. Los GC regulan la producción de citoquinas Th1 y Th2 y favorecen un shift hacia la diferenciación del linaje Th2. En esta tesis estudiamos la regulación por GC de dichos FT y cual es el mecanismo molecular intrínseco implicado en dicha regulación. En experimentos de transfección en los que usamos como blancos de la actividad de T-bet y de GATA-3 los promotores de IFN-g y de IL-5 respectivamente y también directamente los elementos de respuesta de T-bet y de GATA-3 clonados río arriba del gen de la luciferasa, vimos que los GC inhiben fuertemente y de manera dosis dependiente la actividad transcripcional de T-bet y también, en menor medida, la de GATA-3. La acción de los GC es revertida por el antagonista, RU38486, mostrando la especificidad del receptor de glucocorticoides (GR) en la inhibición. Estudios de coinmunoprecipitación muestran que la interacción proteína-proteína entre el GR y T-bet está involucrada en la inhibición de la actividad transcripcional de T-bet. Además, ensayos de EMSA muestran que los GC inhiben la unión de T-bet al DNA, lo cual se muestra también en el contexto celular por ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina. Al contrario, GATA-3 no interactúa directamente con el GR, pero la actividad transcripcional directa de GATA-3 sobre los elementos de respuesta de GATA-3 es inhibida por GC sin afectar el pegado de GATA-3 al DNA. Bajo condiciones de activación los GC inhibirían la actividad de GATA-3 inhibiendo la fosforilación inducida por PKA/p38 MAPK. Además vimos que en cultivos primarios de esplenocitos de ratón, los GC inhiben tanto la expresión del RNAm y la proteína de ambos, T-bet y GATA-3. De manera consistente con su acción inmunosupresora, los GC inhiben tanto la expresión como la actividad transcripcional de los factores de transcripción claves T-bet y GATA-3, pero por medio de diferentes mecanismos moleculares. Esta tesis aporta a la comprensión de la regulación del fenotipo Th1/Th2 mediada por GC.
Glucocorticoid (GC) immunosuppressive and anti-inflammatory action involves the regulation of several transcription factors (TF) such as NF-kB, AP-1, NFAT and STAT family members. Transcription factors T-bet and GATA-3 are pivotal for the acquisition of Th1 or Th2 phenotype, respectively. GC regulate both Th1 and Th2 cytokines and favor a shift towards Th2 differentiation. In this thesis we study GC regulation of these master TF and the intrinsic molecular mechanism involved in this regulation. GC strongly inhibit dose-dependently T-bet and to a lesser degree, GATA-3 transcriptional activity in transfection experiments using as targets of T-bet and GATA-3 activity the IFN-g and IL-5 promoters respectively and also directly the T-bet and GATA-3 response elements cloned upstream of the luciferase gene. GC action is reverted by the antagonist, RU38486, showing the glucocorticoid receptor (GR) specificity in the inhibition. Coimmunoprecipitation studies show that protein-protein interaction between GR and T-bet is involved in the inhibition of T-bet transcriptional activity. Furthermore, EMSA assays show that GC inhibit Tbet- DNA binding, which is shown also in the cell context by chromatin immunoprecipitation assays. On the contrary, GATA-3 does not directly interact with the GR but the direct transcriptional activity of GATA-3 on GATA-3 response elements is inhibited by GC without affecting the binding of GATA-3 to the DNA. Under activating conditions, GC may inhibit GATA-3 activity due to the inhibition of GATA-3 phosphorylation triggered by PKA/p38 MAPK. Furthermore, in naive mice splenocyte cultures, GC inhibit both T-bet and GATA-3 mRNA and protein expression. Consistent with its immunosuppressive action, GC inhibit both T-bet and GATA-3 master transcription factors expression and transcriptional activity, but by means of different molecular mechanisms. All together this thesis contributes to the understanding of GC mediated regulation of Th1/Th2 phenotype.
Fil: Liberman, Ana Clara. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.