Mutaciones en la fructosa-1,6-bisfosfatasa de los cloroplastos para modificar su afinidad por metales y el pH óptimo de catálisis

• Autores: Senn, Alejandro Marcelo
• Año de publicación: 2007
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Wolosiuk, Ricardo A.
• Materia: FOSFOMONOESTERASAS; FOSFATASAS; FRUCTOSA-1,6-BISFOSFATASA; SCREENING FUNCIONAL; AFINIDAD POR METALES; PH OPTIMO; PHOSPHOMONOESTERASES; PHOSPHATASES; FRUCTOSE-1,6-BISPHOSPHATASE; FUNCTIONAL SCREENING; METAL AFFINITY; OPTIMUM PH
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La fructosa-1,6-bisfosfatasa (FBPasa) es una enzima que cataliza la hidrólisis de la fructosa 1,6-bisfosfato para dar fructosa 6 fosfato y fosfato inorgánico (EC 3.1.3.11). Pertenece a una familia de fosfomonoesterasas que se caracterizan por el requerimiento estricto de un metal bivalente (principalmente Mg2+) que sirve como cofactor durante la catálisis. Además en mayor o menor medida todas son inhibidas por Li+. En esta tesis se trabajó con la FBPasa de cloroplastos (CFBPasa) de colza que integra el ciclo de Benson-Calvin cuya función principal es la fijación del dióxido de carbono. La luz modula la actividad del ciclo en el estroma del cloroplasto mediante (a) procesos de óxido/reducción y (b) la variación de la concentración de iones y metabolitos (e.g. Mg2+ y pH). La CFBPasa es clave en este proceso de regulación pues su actividad resulta fuertemente modificada por todos los factores antes mencionados. Nos propusimos investigar los mecanismos moleculares a través de los cuales la CFBPasa responde a las variaciones en las concentraciones de cationes y de pH. Para ello efectuamos dos ciclos de mutagénesis al azar y seleccionamos posteriormente las mutantes que exhibían un comportamiento diferente frente a la inhibición por Ca2+. Previamente fue necesario desarrollar un nuevo método de screening de la actividad fosfatasa que se distinguiese de los métodos reportados anteriormente por utilizar el sustrato específico de la enzima. Como resultado del screening funcional se obtuvieron principalmente tres mutantes, corroboradas por mutaciones sitio dirigida de la enzima nativa: 1) I271S: Presentó menor inhibición por Li+ respecto a la enzima nativa y su pH óptimo de catálisis se desplazó hacia regiones más alcalinas, característica relevante en la forma oxidada de la enzima. 2) I271S/A107V: La incorporación de la mutación A107V revirtió el pH óptimo de catálisis al de la enzima nativa. 3) A107V: Esta mutante presentó una mayor afinidad por el Mg2+ mientras que las demás propiedades bioquímicas fueron similares a las de la enzima nativa. El análisis de la posición estructural de las mutaciones y sus interacciones con el entorno nos llevó a postular fundamentalmente dos hipótesis: 1) Existe una hélice α que influye en el pKa del sitio activo. 2) Las interacciones hidrofóbicas de la Tyr305 (aminoácido que integra el motivo secuencial de las fosfomonoesterasas) son importantes para la regulación de la afinidad por metales.
Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of fructose 1,6-bisphosphate to fructose 6-phosphate and inorganic phosphate (EC 3.1.3.11). This enzyme belongs to a family of phosphomonoesterases that strictly require a bivalent metal (mainly Mg2+) as a cofactor in catalysis. Moreover, all these enzymes are inhibited by Li+. In the present study, we analyzed chloroplast rapeseed FBPase (CFBPase), a key enzyme of the Benson-Calvin cycle for the photosynthetic fixation of carbon dioxide. Light modulates the activity of the cycle in the chloroplast stroma through (a) redox processes and (b) changes in the concentration of ions and metabolites (e.g. Mg2+ and pH). CFBPase is critical in this process of regulation because its activity is modified by all the abovementioned factors. We deemed it was desirable to investigate the molecular mechanisms involved in the response of CFBPase to variations in the concentrations of cations and pH. Therefore, we performed two cycles of random mutagenesis and selected variants that exhibited a different response to the inhibition by Ca2+. To this end, we previously developed a novel method of screening for the phosphatase activity, distinguished from previously reported ones in the utilization of the enzyme’s specific substrates. As a result of the functional screening we obtained mainly three mutants, subsequenly confirmed by site-directed mutagenesis of the native enzyme: 1) I271S: this variant was less inhibited by Li+ than the native enzyme and its catalytic optimum pH shifted to more alkaline regions, a relevant feature in the context of the oxidized form of the enzyme 2) I271S/A107V: the incorporation of the mutation A107V reverted the catalytic optimum pH of the first mutation to that of the native enzyme 3) A107V: this mutant showed higher affinity for Mg2+ while other biochemical characteristics were similar to the native enzyme. The analysis of the position and interactions of the mutated residues led us to postulate two main hypotheses: 1) an α-helix influences the pKa of the active site 2) the hydrophobic interactions of Tyr305 (an amino acid in the phosphomonoesterase motif) are important for the regulation of metal affinity.
Fil: Senn, Alejandro Marcelo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.