Modulación de la expresión del gen MTND4 mitocondrial mediada por la actividad del CFTR

• Autores: Valdivieso, Angel Gabriel
• Año de publicación: 2009
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Santa Coloma, Tomás Antonio
• Materia: FIBROSIS QUISTICA; CFTR; MTND4; COMPLEJO I MITOCONDRIAL; ROS; APOPTOSIS; CYSTIC FIBROSIS; CFTR; MTND4; MITOCHONDRIAL COMPLEX I; ROS; APOPTOSIS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La Fibrosis Quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva producida por mutaciones en el gen que codifica el canal de cloruro CFTR. Mediante la metodología de “Differential Display” (DD) detectamos que la expresión del gen mitocondrial MTND4 está regulada negativamente en FQ. MTND4 es un gen que codifica para la subunidad ND4 del Complejo I mitocondrial (CIm). Esta subunidad es fundamental para la correcta actividad del CIm. Nuestro objetivo principal fue determinar si la reducción de la expresión de MTND4 en FQ induciría una falla en la actividad del CIm. Primero, validamos los resultados del DD mediante RT-PCR semi-cuantitativa en células FQ (CFDE) así como también en células donde la expresión del CFTR había sido corregida (CFDE/6RepCFTR) y en células CFDE/6RepCFTR tratadas con inhibidores de la actividad del CFTR (glibenclamida y CFTR(inh)- 172). A su vez, medimos la actividad del CIm mediante la técnica “Blue Native- PAGE”, en mitocondrias extraídas desde diferentes modelos de células FQ. Así, observamos una disminución significativa de la actividad del CIm en los distintos modelos FQ. También detectamos un aumento en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células FQ, mediante la sonda diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA). Finalmente, medimos el número de copias de ADN mitocondrial (ADNmt) mediante “Real-Time”-PCR para determinar si existía una disminución en el número de copias que pudiese explicar la reducción de la expresión de MTND4. Sin embargo, no encontramos diferencias significativas entre las células FQ y sus controles. Nuestros resultados sugieren que existe una relación causal entre la falla del CFTR y la disminución de la expresión de MTND4. Esta disminución en la expresión de MTND4 está acompañada de una reducción en la actividad del CIm y por un aumento en la producción de ROS, lo que podría tener un rol trascendental en los procesos inflamatorios y apoptóticos observados en FQ, para los cuales no se conocen los mecanismos ni las implicancias fisiopatológicas.
Cystic fibrosis (CF) is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene encoding CFTR chloride channel. By using the "Differential Display” (DD) methodology, we detected that MTND4 gene expression is downregulated in CF. MTND4 is a mitochondrial gene encoding for the ND4 subunit of mitochondrial Complex I (mCI). This subunit is essential for correct activity of mCI. Our main objective was to determine whether reduced expression of MTND4 in CF induces a failure in the activity of the mCI. First, we validate the DD results by semi-quantitative RT-PCR in CF cells (CFDE) as well as in CFDE cells where CFTR expression has been corrected (CFDE/6RepCFTR) and in CFDE/6RepCFTR cells treated with inhibitors of the CFTR activity (glibenclamide and CFTR(inh)-172). In addition, we measured the mCI activity by using the Blue Native-PAGE technique, on mitochondria extracts from different CF models cells. Thus, we observed a significant decrease in the mCI activity in the different CF models. We also detected, through diacetate 2',7'- dichlororofluorescein probe (DCFH-DA), an increase in the production of reactive oxygen species (ROS) in the different CF cells. Finally, we measured the copy number of mitochondrial DNA (mtDNA) by Real-Time-PCR to determine if there was a decrease in the number of copies that could explain the reduction in the MTND4 expression. However, we found no significant differences between the CF cells and their controls. Our results suggest a causal relationship between CFTR failure and MTND4 decreased expression. This decrease in the MTND4 expression is accompanied by a reduction in the mCI activity and an increased ROS production, which could have an important role in inflammatory and apoptotic processes observed in CF, for which there are no known mechanisms and pathophysiological implications.
Fil: Valdivieso, Angel Gabriel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.