Caracterización funcional de TcCAL1, una nueva proteína con dominios de unión a calcio identificada en Trypanosoma cruzi

• Autores: Rodríguez Durán, Jessica Jenireth
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Potenza, Mariana
• Materia: ENFERMEDAD DE CHAGAS; TRYPANOSOMA CRUZI; INVASION; CALCIO INTRACELULAR; METACICLOGENESIS; CHAGAS DISEASE; TRYPANOSOMA CRUZI; HOST-CELL INVASION; INTRACELLULAR CALCIUM; METACYCLOGENESIS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

En T. cruzi, el ion calcio (Ca2+) juega un papel fundamental en los procesos de metaciclogénesis y en la invasión a la célula hospedadora. TcCAL1 es una proteína de 103 aminoácidos, sin función conocida y exclusiva de kinetoplástidos cuya secuencia contiene dos motivos de unión a Ca2+ del tipo EF-hand. Nos planteamos como hipótesis que TcCAL1 podría actuar como un sensor de los niveles de Ca2+ intracelular T. cruzi, modulando la función de las proteínas con las cuales se asocia. Para probar la hipótesis, se caracterizó funcionalmente a TcCAL1 y se determinó su importancia en el ciclo de vida de T. cruzi. Mediante análisis por RMN, dicroísmo circular y ensayos de fluorescencia utilizando el indicador de calcio Quin-2, se estudió la capacidad de unión a Ca2+ de la proteína TcCAL1 recombinante (TcCAL1x6His). Mediante microscopia de inmunofluorescencia, se determinó que TcCAL1 se localiza en todo el cuerpo celular de amastigotes, tripomastigotes metacíclicos y epimastigotes. Se obtuvieron cultivos que sobreexpresan TcCAL1x6His y se estudió el fenotipo en varios procesos del ciclo de vida del parásito. Se demostró que la sobreexpresión de TcCAL1x6His inhibe la metaciclogénesis y provoca un aumento significativo tanto en los índices de adhesión como en los índices de infección de tripomastigotes metacíclicos a células Vero. Asimismo, se encontró que los niveles expresión de TcCAL1 endógena son significativamente mayores en tripomastigotes respecto a amastigotes axénicos o epimastigotes. No se observaron diferencias en la fase exponencial de proliferación de epimastigotes o en la amastigogénesis in vitro cuando se compararon los parásitos que sobreexpresan TcCAL1x6His con los controles. Se obtuvieron parásitos que presentan una disminución de la expresión de TcCAL1 (hemi-knockout) mediante el sistema CRISPR/CAS9, que no mostraron diferencias significativas en la proliferación se compararon con los controles. También, se determinaron los niveles intracelulares de Ca2+ intracelular en los parásitos que sobreexpresan TcCAL1x6His cuando se compararon con los cultivos control. Finalmente, se identificaron dos proteínas que interaccionan con TcCAL1, anotadas en el genoma de T. cruzi como proteínas sin caracterizar. La función de estas proteínas y la relación con TcCAL1 en su rol como posible factor de virulencia son aspectos interesantes que se derivan de este trabajo y que promueven nuevas investigaciones.
In T. cruzi, the calcium ion (Ca2+) plays a fundamental role in the processes of metacyclogenesis and host cell invasion. TcCAL1 is a 103-amino acid protein, with unknown function, exclusive to kinetoplastids, and has two EF-hand-type Ca2+ binding motifs in its sequence. We hypothesized that TcCAL1 might function as an intracellular Ca2+ sensor in T. cruzi, thereby modulating the activity of the proteins with which it interacts. To test this hypothesis, we functionally characterized TcCAL1 and determined its importance in the life cycle of T. cruzi. Using NMR analysis, circular dichroism, and fluorescence assays with the calcium indicator Quin-2, we studied the Ca2+ binding capacity of recombinant TcCAL1 protein (TcCAL1x6His). We found that TcCAL1 is located throughout the cellular body of amastigotes, metacyclic trypomastigotes, and epimastigotes by immunofluorescence microscopy. We obtained transgenic cultures overexpressing TcCAL1x6His and studied their phenotype in various stages of the parasite's life cycle. Results showed that the overexpression of TcCAL1x6His inhibits metacyclogenesis and significantly increases both adhesion rates and infection rates of metacyclic trypomastigotes to Vero cells. Additionally, we found that endogenous TcCAL1 expression levels are significantly higher in trypomastigotes compared to axenic amastigotes or epimastigotes. No differences were observed in the proliferation of epimastigotes or in vitro amastigogenesis parasites overexpressing TcCAL1x6His compared with wild type counterparts. We generated parasites with reduced TcCAL1 expression (hemi-knockout) using the CRISPR/CAS9 system. These parasites showed no significant differences in proliferation or metacyclogenesis compared to controls. Intracellular calcium levels were also determined in parasites overexpressing TcCAL1x6His and compared to control cultures. Finally, two proteins that interact with TcCAL1 were identified through yeast two-hybrid assays, both annotated as uncharacterized proteins in the T. cruzi genome. The function of these proteins and their relationship with TcCAL1 in its potential role as a virulence factor are intriguing aspects that arise from this work and promote further research.
Fil: Rodríguez Durán, Jessica Jenireth. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.