La arginina quinasa de Trypanosoma cruzi : estudio de su regulación y utilización de modelos transgénicos

• Autores: Alonso, Guillermo Daniel
• Año de publicación: 2002
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Flawiá, Mirtha Marta
• Materia: FOSFAGENOS; ARGININA QUINASA; TRYPANOSOMA CRUZI; GUANIDINO QUINASA; FOSFOARGININA; TRANSPORTE DE ARGININA; INCORPORACION DE ARGININA; PHOSPHAGEN; ARGININE KINASE; TRYPANOSOMA CRUZI; GUANIDINO KINASE; PHOSPHOARGININE; ARGININE TRANSPORT; ARGININE UPTAKE
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La arginina quinasa cataliza la transferencia reversible de un grupo fosfato entreel ATP y la L-arginina. En este trabajo se reporta modelos de sobre-expresiónexitosos para una enzima endógena, como es el caso de la arginina quinasa. Seobtuvieron 60 veces de sobre-expresión, utilizando el vector de expresión de altaeficiencia pTREX-A. La población transfectada con la arginina quinasa presentó unaumento en la densidad celular y en la tasa de replicación, sugiriendo que losfosfágenos podrían estar involucrados en la división celular. Además, la actividadarginina quinasa aumento continuamente durante la fase exponencial decrecimiento. Se observó una correlación entre la tasa de crecimiento, la actividadarginina quinasa y los niveles de enzima. En el rango de tiempo de cultivoestudiado, los niveles de ARNm mostraron solo cambios menores. La sobreexpresiónde la arginina quinasa presentó una cinética de degradación a lo largode la curva de crecimiento coincidente con el aumento de la enzima endógena yde la actividad, indicando una posible regulación por proteólisis. La incorporación de arginina fue estudiada en epimastigotes de Trypanosomacruzi durante las fases del cultivo in vitro. La incorporación de arginina disminuyócontinuamente desde el 3ro al 14to día. Estas variaciones pueden ser reproducidasutilizando medio condicionado o medio fresco. El ayuno de arginina, la densidadcelular y la disponibilidad de Fuentes de carbono, también afectaron laincorporación. En tripomastigotes, el estadio infectivo no replicativo, la actividad yexpresión arginina quinasa fueron 2.2 veces superior a la correspondiente aepimastigotes del 7mo día, y la incorporación de arginina fue al menos 30 vecesmenor en tripomastigotes que en epimastigotes del 7mo dia. Además unadisminución reversible del 40 % de la arginina incorporada fue observado cuandocélulas del día 3 fueron tratadas con el agente antimitótico, hidroxi urea. Estosresultados sugieren una relación entre la incorporación de arginina, la tasa deduplicación celular, y el aumento en la actividad arginina quinasa.
Arginine kinase catalyzes the reversible transphosphorylation between ATP and L-arginine.This work reports one of the first successful over-expression models ofan endogenous enzyme, such as arginine kinase. Thus, it was obtained a 60-foldover-expression using the high-efficiency expression vector pTREX-A. The cellstransfected with arginine kinase showed an increase in cell density and replicationrate, suggesting that phosphagens could be involved in cell division. Furthermore,the arginine kinase activity was increased continuously during the exponentialphase of growth. A correlation between growth rate, enzyme-specific activity andenzyme protein was observed. In the whole range of the culture time mRNA levelsshowed minor changes. Overexpressed arginine kinase has a degradation kineticsalong the parasite growth curve coincident with the increment of the endogenousenzyme protein and activity, indicating that arginine kinase activity might beregulated by proteolysis. Arginine uptake was measured in Trypanosoma cruzi epimastigote cells along thein vitro culture growth phases. Arginine uptake decreased continuously from the 3rd to the 14th day. These fluctuations could be resembled using conditioned orfresh medium. Arginine starvation, cell density and carbon source availability alsoaffect the arginine uptake. In trypomastigote cells, the infective and nonreplicativestage, arginine kinase activity and expression were 2.2-fold higherthan 7th-day epimastigote activity, and arginine uptake was at least 30-fold lowerin trypomastigote than 7th-day epimastigote forms. Moreover, a reversible 40%decrease of the arginine uptake was observed when 3rd-day cells were treatedwith the antimitotic hidroxyurea. These results suggest a correlation betweenarginine uptake, the cell replication rate, and the increase in the arginine kinasespecific activity.
Fil: Alonso, Guillermo Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.