Estudio del dominio carboxilo terminal de SlpA de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 para la exhibición de proteínas heterólogas en la superficie de bacterias ácido lácticas

• Autores: Jastrebow, Iara Gabriela
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de grado
• Colaborador/a o director/a de tesis: Palomino, María Mercedes; Gordillo, Tania Belén
• Materia: LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS; CAPA-S; DOMINIO CARRIER; PROTEINA DE FUSION; PRESERVACION; LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS; S-LAYER; CARRIER DOMAIN; FUSION PROTEIN; PRESERVATION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las proteínas de capa-S (S-layer) prometen ser una gran herramienta de anclaje para desarrollar sistemas de display en la superficie de bacterias probióticas, como Lactobacillus acidophilus ATCC 4356. En este estudio se evaluó, específicamente, el uso del extremo carboxilo-terminal (C-terminal) de SlpA, la proteína principal de capa-S en esta especie, responsable de la unión a la superficie celular, para exhibir proteínas heterólogas. Para ello, se clonaron los dos dominios SLAP, que constituyen el C-terminal completo (CT) de SlpA, en quimeras con la proteína verde fluorescente (GFP) utilizando sistemas heterólogos en Escherichia coli. Se emplearon los vectores pET28-GFP con las construcciones correspondientes a SLAP1, SLAP2 y CTSlpA, con el objetivo de evaluar el potencial de cada dominio como carrier para la exhibición de proteínas heterólogas funcionales en la superficie de bacterias ácido láctica (BAL). La proteína GFP-SLAP1 fue expresada y purificada, y posteriormente utilizada en ensayos de binding a L. acidophilus desprovista de su capa-S nativa. La capacidad de unión fue analizada mediante microscopía de fluorescencia, mostrando que SLAP1 por sí solo no resulta suficiente para lograr un decorado efectivo de las bacterias. En cuanto a GFP-SLAP2, se realizó todo el clonado y se logró expresar la proteína quimera, sin embargo, ésta se acumula en cuerpos de inclusión. Esto último implicaría complicaciones técnicas y costos adicionales en el proceso de producción, lo que no resulta atractivo ni práctico para utilizarlo, eventualmente, a gran escala. Con el objetivo de optimizar el protocolo de binding, se llevaron a cabo ensayos utilizando GFP-CTSlpA. Los resultados mostraron que reducir los tiempos de incubación a 45 minutos permite alcanzar un nivel de unión equivalente al obtenido tras una hora, lo que representa una mejora en la eficiencia del ensayo. Aunque en intervalos de incubación más cortos, de 5 a 30 minutos, la unión tiende a ser menor, las diferencias observadas no son estadísticamente significativas. Para evaluar la viabilidad de las células probióticas decoradas en el tiempo, se realizaron ensayos de preservación a 4 °C. Los resultados indicaron que el decorado con GFP-CTSlpA produce un aumento significativo en la supervivencia de L. acidophilus durante el almacenamiento en refrigeración. Adicionalmente, durante los primeros 14 días de esta preservación en heladera, se midió la estabilidad del binding, que se mantuvo constante durante los primeros 7 días, mientras que a los 14 días no se registraron diferencias significativas. Esto sugiere que la estrategia de decoración podría mejorar la estabilidad y viabilidad de las bacterias probióticas, lo que tiene implicancias positivas para su conservación y uso en aplicaciones funcionales. Finalmente, se evaluó la liofilización como una estrategia para preservar Lactobacillus acidophilus de forma más estable a largo plazo. Sin embargo, se observó que esta bacteria no tolera bien el proceso, con una reducción drástica de su viabilidad a menos del 0,2% del nivel inicial. Para mitigar este efecto, se realizaron ensayos con distintos protectores, incluyendo suero de queso, leche, trehalosa y lactosa. Todos ellos demostraron ser efectivos, logrando mantener la viabilidad de las bacterias significativamente más alta, con valores entre el 40% y el 50%. Estos resultados destacan el potencial de las proteínas de capa-S (S-layer) como herramientas para la exhibición de proteínas funcionales en bacterias probióticas, sin necesidad de modificaciones genéticas. Esto permite conservar el estatus GRAS (Generally Recognized As Safe) de las bacterias, lo que amplía sus posibilidades de aplicación en biotecnología y productos funcionales.
S-layer proteins are a promising anchoring tool for the development of heterologous protein display systems on the surface of probiotic bacteria, like Lactobacillus acidophilus ATCC 4356. Specifically, this study explores the use of the carboxyl terminus (C-terminus) of the main S-layer protein of this species, SlpA, which is known to be responsible for cell wall binding. To this end, the two SLAP domains, which make the whole SlpA C-terminus (CT), were cloned in chimeras with the green fluorescent protein (GFP). pET28-GFP vectors with SLAP1, SLAP2, and CTSlpA were utilized to evaluate the carrier potential of each independent domain for the display of functional proteins on the surface of lactic acid bacteria (LAB). The GFP-SLAP1 fusion protein was expressed in Escherichia coli and later purified. It was then used in binding assays to L. acidophilus, which had previously been stripped of its native S-layer. After these assays, the binding capacity was analyzed through flow cytometry. Results showed that SLAP1 alone was not enough to decorate the bacteria. GFP-SLAP2 was cloned into heterologous E. coli systems, and the chimeric protein was successfully produced. However, it aggregated into inclusion bodies. This would imply extra difficulties and costs in the production process, making it impractical and unattractive for its eventual large-scale use. Aiming to optimize the binding protocol, assays utilizing GFP-CTSlpA were carried out. These demonstrated that an equivalent level of decoration can be achieved by reducing the time from 60 to 45 minutes, implying an improvement in the essay’s efficiency. From 5 to 30 minutes of incubation time, despite noticing a tendency towards lower decoration levels, these did not translate into significant differences. To evaluate the viability of the decorated cells over time, preservation assays at 4 °C were carried out. Results indicated that decoration with GFP-CTSlpA produces a significant increase in the viability of L. acidophilus during this refrigerated storage. Additionally, during the first 14 days of this time in the fridge, the stability of the binding was measured. The decoration levels remained constant during the first 7 days, and still, by day 14, no significant differences from the input were registered. This suggests that this decoration strategy could improve the stability and viability of the probiotic bacteria, which has positive implications for its conservation and use in functional applications. Finally, the strategy of freeze-drying or lyophilization was considered to preserve the bacteria more stably and for a longer time. However, L. acidophilus does not withstand the process well, reducing its cell count to less than 0.2% of the input. To counter this, several protectants were trialed: cheese whey, milk, lactose, and trehalose. All four were successful, resulting in four candidate protectants through which bacterial viability remains significantly higher (between 40 and 50% of the input). These advances highlight the potential of S-layer proteins as tools for heterologous functional protein display in probiotic bacteria without the need for genetic modification. This allows them to keep their GRAS (Generally Recognized as Safe) status, which widens the horizons regarding their application in biotechnological and functional products.
Fil: Jastrebow, Iara Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.