Estudio del dominio carboxilo terminal de SlpA de Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 para la exhibición de proteínas heterólogas en la superficie de bacterias ácido lácticas - Jastrebow, Iara Gabriela (2024)
Las proteínas de capa-S (S-layer) prometen ser una gran herramienta de anclaje para desarrollar sistemas de display en la superficie de bacterias probióticas, como Lactobacillus acidophilus ATCC 4356. En este estudio se evaluó, específicamente, el uso del extremo carboxilo-terminal (C-terminal) de SlpA, la proteína principal de capa-S en esta especie, responsable de la unión a la superficie celular, para exhibir proteínas heterólogas. Para ello, se clonaron los dos dominios SLAP, que constituyen el C-terminal completo (CT) de SlpA, en quimeras con la proteína verde fluorescente (GFP) utilizando sistemas heterólogos en Escherichia coli. Se emplearon los vectores pET28-GFP con las construcciones correspondientes a SLAP1, SLAP2 y CTSlpA, con el objetivo de evaluar el potencial de cada dominio como carrier para la exhibición de proteínas heterólogas funcionales en la superficie de bacterias ácido láctica (BAL). La proteína GFP-SLAP1 fue expresada y purificada, y posteriormente utilizada en ensayos de binding a L. acidophilus desprovista de su capa-S nativa. La capacidad de unión fue analizada mediante microscopía de fluorescencia, mostrando que SLAP1 por sí solo no resulta suficiente para lograr un decorado efectivo de las bacterias. En cuanto a GFP-SLAP2, se realizó todo el clonado y se logró expresar la proteína quimera, sin embargo, ésta se acumula en cuerpos de inclusión. Esto último implicaría complicaciones técnicas y costos adicionales en el proceso de producción, lo que no resulta atractivo ni práctico para utilizarlo, eventualmente, a gran escala. Con el objetivo de optimizar el protocolo de binding, se llevaron a cabo ensayos utilizando GFP-CTSlpA. Los resultados mostraron que reducir los tiempos de incubación a 45 minutos permite alcanzar un nivel de unión equivalente al obtenido tras una hora, lo que representa una mejora en la eficiencia del ensayo. Aunque en intervalos de incubación más cortos, de 5 a 30 minutos, la unión tiende a ser menor, las diferencias observadas no son estadísticamente significativas. Para evaluar la viabilidad de las células probióticas decoradas en el tiempo, se realizaron ensayos de preservación a 4 °C. Los resultados indicaron que el decorado con GFP-CTSlpA produce un aumento significativo en la supervivencia de L. acidophilus durante el almacenamiento en refrigeración. Adicionalmente, durante los primeros 14 días de esta preservación en heladera, se midió la estabilidad del binding, que se mantuvo constante durante los primeros 7 días, mientras que a los 14 días no se registraron diferencias significativas. Esto sugiere que la estrategia de decoración podría mejorar la estabilidad y viabilidad de las bacterias probióticas, lo que tiene implicancias positivas para su conservación y uso en aplicaciones funcionales. Finalmente, se evaluó la liofilización como una estrategia para preservar Lactobacillus acidophilus de forma más estable a largo plazo. Sin embargo, se observó que esta bacteria no tolera bien el proceso, con una reducción drástica de su viabilidad a menos del 0,2% del nivel inicial. Para mitigar este efecto, se realizaron ensayos con distintos protectores, incluyendo suero de queso, leche, trehalosa y lactosa. Todos ellos demostraron ser efectivos, logrando mantener la viabilidad de las bacterias significativamente más alta, con valores entre el 40% y el 50%. Estos resultados destacan el potencial de las proteínas de capa-S (S-layer) como herramientas para la exhibición de proteínas funcionales en bacterias probióticas, sin necesidad de modificaciones genéticas. Esto permite conservar el estatus GRAS (Generally Recognized As Safe) de las bacterias, lo que amplía sus posibilidades de aplicación en biotecnología y productos funcionales.