Mecanismos de acción de RSUME sobre la función del supresor tumoral VHL y su impacto en el desarrollo del sindrome VHL asociados a la desregulación de HIF

• Autores: Tedesco, Lucas
• Año de publicación: 2018
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Arzt, Eduardo Simón
• Materia: HIF; VHL; SINDROME VON HIPPEL-LINDAU; UBIQUITINACION; RSUME; RWDD3; SUMOILACION; VEGF; HIF; VHL; VON HIPPEL-LINDAU SINDROME; UBIQUITINATION; RSUME; RWDD3; SUMOYLATION; VEGF
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Los factores HIF son heterodímeros compuestos por dos subunidades, y β. Mientras que los niveles de HIF-β son constitutivos, la estabilidad y actividad de las subunidades HIF-1α y HIF-2α están finamente reguladas por los niveles de O2: contienen un dominio de degradación dependiente de oxígeno (ODD) que en normoxia es blanco de hidroxilación. Cuando HIF-α está hidroxilada puede interactuar con el supresor tumoral von Hippel-Lindau (VHL), que conformando un complejo proteico con Elonguina C, Elonguina B, Cullina-2 y Rbx-1 promueve la poliubiquitinación de HIF-α, señal necesaria para su posterior degradación. El sindrome de VHL es causado por mutaciones en el gen de VHL, que llevan a una inactivación total o parcial de su función y generan que la estabilidad de HIF-1α y HIF-2α sea independiente de los niveles de O2, generando una actividad constitutiva de HIF. La desregulación de las vías dependientes de HIF conduce a la aparición de tumores altamente vascularizados como producto de la desregulación de factores pro-angiogénicos como VEGF. En el sindrome de VHL estos tumores aparecen en el sistema nervioso central y retina (Hemangioblastomas), en la glándula adrenal (Feocromocitomas) y en el riñón (Carcinoma Renal de Células Claras o RCC), entre otros tejidos. Resulta de interés determinar los mecanismos involucrados que en la pérdida de función de las mutantes VHL que promueven el establecimiento de tumores dependientes de VHL-HIF. Nuestro grupo de trabajo aisló a la proteína RWDD3 o RSUME (RWD domain-containing protein SUMOylation Enhancer) que se induce en condiciones de estrés celular y participa a la modificación post-traduccional conocida como sumoilación. En particular, se demostró que RSUME se expresa en hipoxia (HPX) e incrementa la sumoilación de HIF-1α, aumentando su estabilidad y actividad transcripcional. En normoxia, RSUME aumenta los niveles de HIF-1α incluso al sobre-expresar VHL, indicando una posible inhibición funcional de RSUME sobre VHL. RSUME se expresa en los tejidos característicos del sindrome. Además, mayores niveles de ARN de RSUME en tumores RCC correlacionan con un peor pronóstico de los pacientes, indicando que RSUME podría ser un marcador a tener en cuenta en el desarrollo de la enfermedad. El objetivo de esta Tesis fue caracterizar el mecanismo molecular de acción de RSUME sobre el sistema VHL-HIF. En el contexto de la enfermedad VHL, el trabajo se centró en estudiar la función de RSUME en el establecimiento de tumores VHL analizando su rol y mecanismos de acción sobre la pérdida de función de las mutantes de VHL. En primer lugar, utilizando un modelo celular que carece de expresión de VHL (la línea celular RCC-786-O) determinamos que RSUME sólo afecta la estabilidad de HIF-1α y HIF-2α cuando VHL se expresa ectópicamente. RSUME bloquea la degradación de HIF inhibiendo la ubiquitinación de HIF dependiente de VHL. Confirmando que los efectos de RSUME son directos sobre la función de VHL, observamos que RSUME bloquea la degradación de otros blancos de ubiquitinación de VHL. Determinamos que RSUME y VHL interactúan sin intermediarios. En el contexto celular, RSUME forma un complejo con el dímero VHL-HIFα, que disminuye la interacción de VHL con HIF-1 y 2, y así, aumenta la estabilidad de estas últimas. Dado que RSUME es un potenciador de sumoilación, se determinó que RSUME modula positivamente la sumoilación de VHL tanto in vitro como in vivo. Sin embargo, observamos que RSUME bloquea la acción de VHL incluso cuando se inhibe la sumoilación general o se usa una mutante no sumoilable de VHL, indicando que la acción de RSUME es independiente de su efecto sobre la sumoilación de VHL. Luego, analizamos el impacto de RSUME sobre el establecimiento de la enfermedad VHL. Detectamos la expresión proteica de RSUME en muestras tumorales de pacientes VHL, confirmando un posible rol de RSUME en los tumores. Además, determinamos que, a diferencia de VHL salvaje, mutantes de VHL características de la enfermedad son incapaces de inhibir la expresión de RSUME sugiriendo un potencial mecanismo de desregulación de RSUME en el contexto tumoral asociado a VHL. En el estudio de los mecanismos de acción de RSUME, determinamos que la sobreexpresión de RSUME potencia la pérdida de función de las mutantes de VHL, evidenciado por una mayor estabilidad y actividad transcripcional de HIF-2α. RSUME actúa independientemente de su capacidad de sumoilar a las mutantes de VHL. RSUME se une a las diferentes variantes de VHL, promoviendo una disminución en su interacción con HIF-2α y en la formación del complejo ECV, aumentando la estabilidad de los blancos de ubiquitinación. Utilizando clones generados en un modelo celular de la enfermedad de VHL en los que silenciamos la expresión de RSUME, verificamos el rol crítico de RSUME en la perdida de función de VHL. Menores niveles de RSUME resultaron en una ganancia de función en VHL, lo que se tradujo en una disminución en la vascularización asociada a VEGF y en tumores más pequeños y menos vascularizados. En conclusión, estudiando la función de RSUME en distintos modelos experimentales y a través de estrategias experimentales complementarias, nuestros resultados evidencian el rol fundamental de RSUME en el síndrome VHL y proponen mecanismos moleculares para explicar la acción de RSUME sobre VHL, enfatizando que RSUME no sólo es un promotor de la sumoilación sino que –como en el caso de VHL- regula a otras proteínas a través de la formación de complejos proteicos que modifican su función.
HIF factors are heterodimers composed by two subunits, and β. While HIF-β levels are constitutive, the stability and activity of the HIF-1α and HIF-2α are finely regulated by O2: they contain an oxygen-dependent degradation domain (ODD) that in normoxia is hydroxylated. When HIF-α is hydroxylated it interacts with the tumor suppressor von Hippel-Lindau (VHL), which forms a protein complex with Elongin C, Elongin B, Cullin-2 and Rbx-1 and promotes HIF-α polyubiquitination, necessary for its subsequent degradation. VHL syndrome is caused by mutations in VHL gene, which lead to a total or partial inactivation of its function. As consequence HIF-1α and HIF-2α stability become independent of the O2 levels, generating a constitutive activity of HIF. Overactivation of HIF dependent pathways leads to deregulation of pro-angiogenic factors such as VEGF, causing the appearance of highly vascularized tumors as a result of the. In VHL syndrome these tumors appear in the central nervous system and retina (Hemangioblastoma), in the adrenal gland (Pheochromocytoma) and in the kidney (Clear Renal Cell Carcinoma or RCC), among other tissues. It is of interest to determine the mechanisms involved in the loss of function of the VHL mutants that promote the establishment of VHL-HIF dependent tumors. Our group isolated the protein RWDD3 or RSUME (RWD domain-containing protein SUMOylation Enhancer), which is induced in cellular stress conditions and participates in the post-translational modification known as sumoylation. In particular, it was shown that RSUME is expressed in hypoxia (HPX) and increases the sumoylation of HIF-1α, increasing its stability and transcriptional activity. In normoxia, RSUME increases the levels of HIF-1α even when over-expressing VHL, indicating a possible functional inhibition of RSUME on VHL. RSUME is expressed in the tissues prone to develop VHL syndrome tumors. In addition, higher levels of RSUME RNA in RCC tumors correlate with a worse prognosis in patients, indicating that RSUME could be a marker to be taken into account in the development of the disease. The objective of this Thesis was to characterize the molecular mechanism of action of RSUME on the VHL-HIF system. In the context of VHL disease, this work has focused on studying the role of RSUME in the establishment of VHL tumors by analyzing the mechanisms of action on the loss of function of VHL mutants. First, using a cellular model that lacks VHL expression (cell line RCC-786-O) we determined that RSUME only affects the stability of HIF-1α and HIF-2α when VHL is ectopically expressed. RSUME blocks the degradation of HIF by inhibiting VHL-dependent HIF ubiquitination. Confirming that RSUME acts directly on VHL function, we observed that RSUME blocks the degradation of other VHL ubiquitination targets. Additionally, RSUME and VHL interact without intermediaries. In the cellular context, we determined that RSUME forms a complex with the VHL-HIF dimer and decreases VHL interaction with HIF-1α and 2α, and thus, increases their stability. As RSUME is a sumoylation enhancer, here it was determined that RSUME positively modulates VHL sumoylation both in vitro and in vivo. However, we observed that RSUME blocks the action of VHL even when general sumoylation was inhibited or a non-sumoilable mutant of VHL was used, indicating that the action of RSUME is independent of its effect on VHL sumoylation. Then, we analyzed the impact of RSUME on the establishment of VHL disease. We detected RSUME protein expression in VHL tumor samples, confirming a possible role of RSUME in these tumors. In addition, we determined that, unlike wild-type VHL, VHL disease mutants were unable to inhibit the expression of RSUME, suggesting a potential deregulation mechanism of RSUME in the tumor context associated with VHL. In the study of possible mechanisms of action of RSUME on VHL mutants, we established that RSUME overexpression potentiates their loss of function, evidenced by increased stability and transcriptional activity of HIF-2. RSUME binds to the VHL mutants, promoting a decrease in its interaction with HIF-2α and ECV complex assembly, thus increasing HIF stability. Using clones generated in a VHL disease cellular model, in which RSUME was silenced, we verified the critical role of RSUME in the loss of VHL function. Lower levels of RSUME resulted in a gain of function in VHL. This resulted in a decrease in VEGF-derived vascularization in vivo and smaller and less vascularized tumors. In conclusion, studying the role of RSUME in different experimental models and through complementary experimental strategies, our results provide new evidences of the fundamental role of RSUME in the VHL syndrome and propose molecular mechanisms to explain the action of RSUME on VHL, emphasizing that RSUME is not only a promoter of sumoylation but -as seen for VHL- regulates other proteins through the formation of complexes that modify its function.
Fil: Tedesco, Lucas. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.