Desarrollo y aplicación de metodologías genómicas para el mejoramiento molecular de Eucalyptus dunnii mediante mapeo por asociación y selección genómica

• Autores: Aguirre, Natalia Cristina
• Año de publicación: 2020
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Marcucci Poltri, Susana Noemí; Rivarola, Máximo Lisandro
• Materia: ddRADSeq; GBS; EUChip60K; SELECCION TEMPRANA; GENES CANDIDATOS; CALIDAD DE MADERA; ddRADSeq; GBS; EUChip60K; EARLY SELECTION; CANDIDATE GENES; WOOD QUALITY
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El género Eucalyptus es uno de los más importantes del mundo y, por ende, su investigación y mejoramiento genético concentra esfuerzos internacionales. En Argentina, el programa de mejoramiento de Eucalyptus se lleva a cabo principalmente por INTA. Eucalyptus dunnii es una de las especies de eucaliptos con alta demanda para producir pasta celulósica de fibra corta, especialmente en aquellas regiones donde otras especies de excelente aptitud papelera como el E. globulus y E. grandis son afectadas por condiciones edafoclimáticas limitantes. Además, presenta buenas características de crecimiento y productividad para su uso como madera sólida, aunque deben ser mejoradas. En ese sentido, las nuevas estrategias de mejoramiento molecular son útiles para dicho propósito. El objetivo del presente trabajo es aplicar mejoramiento molecular en E. dunnii mediante las estrategias de Mapeo por Asociación y Selección Genómica a través del desarrollo y empleo de sistemas de genotipificación de alto rendimiento. Para ello, se optimizó un protocolo de ddRADSeq (Double-digest restriction site-associated DNA sequencing) desarrollándolo en su totalidad en el país. Este protocolo es versátil y útil tanto para un número reducido de muestras, pudiendo ser escalado a cientos de muestras de manera eficiente y robusta, generando información relevante sobre marcadores moleculares SNPs y SSR. Es la primera vez que se aplica esta metodología en E. dunnii, analizándose una población de polinización abierta de 308 individuos (perteneciente a una red de ensayos de orígenes y procedencias del programa de mejoramiento de INTA, implantada en Ubajay, Entre Ríos). Los resultados obtenidos se compararon con la información generada por la aplicación del microarreglo comercial EUChip60K. Se obtuvieron un total de 8.170 (ddRADSeq) y 19.045 (EUChip60K) SNPs, distribuidos a lo largo de los 11 cromosomas y mostrando cobertura de regiones genómicas complementarias. De manera original para esta especie se evaluó la estrategia de Mapeo por Asociación. Se utilizó un modelo lineal y datos fenotípicos para catorce caracteres correspondientes a variables de crecimiento, calidad de madera (densidad básica y propiedades químicas de la madera estimadas mediante NIR (Near Infrared Reflectance)) y tensiones de crecimiento. La estructura poblacional mostró dos grupos genéticos para ambas plataformas de genotipado concordantes entre sí y se evidenció un bajo desequilibrio de ligamiento. Se encontraron 7, 13 y 19 SNPs (ddRADSeq, EUChip60K y matriz conjunta; p < 0,0001) asociados para 12 de las 14 características fenotípicas estudiadas. Para los marcadores asociados se realizó una búsqueda de genes empleando como referencia el genoma de E. grandis y explorando una ventana de 70 Kpb alrededor de los mismos. Se localizaron alrededor de 100 genes, varios de ellos con funciones relacionadas a las características analizadas. Cincuenta genes de distintas rutas metabólicas de la síntesis de celulosa, xilanos, fenilpropanoides, terpenos, lacasas, peroxidasas, entre otros se ubicaron a menos de 500 Kpb de los marcadores encontrados, Por último, se aplicó una prueba de concepto de Selección Genómica con ambas metodologías de genotipificación y se compararon los predictores de mérito genético de acuerdo con su exactitud teórica (evaluación de la varianza del error en la predicción) y habilidad predictiva (correlación entre el fenotipo observado y estimado) respecto de los cálculos de predicciones convencionales. La exactitud teórica para los modelos de predicción con información genómica fue superior respecto del cálculo convencional particularmente para los caracteres de heredabilidad <0,43 (cel20, dap11, dap20, db20). La información genómica generada por ddRADSeq, tuvo mejor desempeño, siendo prácticamente indistinto para el resto de los caracteres. En cambio, la habilidad predictiva fue muy similar para todos los modelos, y el método convencional fue levemente superior para algunos caracteres con heredabilidad <0,43. Las estrategias de mejoramiento molecular evaluadas durante el desarrollo de esta tesis podrán ser incorporadas como herramientas para la selección temprana de genotipos superiores de los programas de mejoramiento de E. dunnii acortando los ciclos de mejora. Asimismo, permitirá disponer de nuevos marcadores y genes candidatos de interés que podrán ser validados en otras poblaciones e incorporados como información para la generación de modelos predictivos de Selección genómica.
The genus Eucalyptus is one of the most important in the world and, therefore, its research and genetic improvement concentrates international efforts. In Argentina, the Eucalyptus breeding program is mainly carried out by INTA. Eucalyptus dunnii is one of the eucalypts species with high demand to produce short-fibre cellulose pulp, especially in those regions where other species of excellent papermaking aptitude such as E. globulus and E. grandis are affected by limiting soil and climate conditions. In addition, it has good growth and productivity traits to be used as solid wood, although they must be improved. In this context, the new strategies of molecular breeding are useful for this purpose. The objective of this work is to apply molecular breeding in E. dunnii through Association Mapping and Genomic Selection and to develop a high-performance genotyping systems. This is the first time that a ddRADSeq (Double-digest restriction site-associated DNA sequencing) protocol is optimized for the species. This protocol is versatile and useful for both a small number of samples, as well as it can be scaled up to hundreds of samples efficiently and robustly, generating relevant information on SNP and SSR molecular markers. This methodology was successfully applied to an open-pollinated population of E. dunnii (308 individuals, belonging to an origin and provenance field trials of the INTA breeding program, located in Ubajay, Entre Ríos). In parallel, and in order to evaluate the potential of this developed methodology, the information generated was analyzed and compared with that of coming from EUChip60K commercial microarray. A total of 8,170 (ddRADSeq) and 19,045 (EUChip60K) SNP were obtained, distributed along the 11 chromosomes and covering complementary genomic regions. For the Association Mapping analysis (pioneer in this species) a mixed linear model and fourteen phenotypic traits data were evaluated: growth, wood quality (basic density and chemical properties of wood estimated by NIR (Near Infrared Reflectance)) and growth stresses. Genetic structure showed two sub populations for both genotyping platforms consistent with each other and a low linkage disequilibrium was evident. Seven, 13 and 19 (ddRADSeq, EUChip60K and joint matrix; p <0.0001) associated SNPs were found for all phenotypic evaluated traits. The associated markers were aligned with the published E. grandis genome sequences and gene mapping positions were carried out within a 70 Kbp window. About 100 genes were located, several of which are potentially related to the analyzed traits. In addition, 50 genes from different metabolic pathways belonging to cellulose and xylanes synthesis, phenylpropanoids, terpenes, laccases, peroxidases, among others, described in public genomic resources were located within 500 Kbp of SNPs mapped in E. grandis genome. Finally, a Genomic Selection concept test was applied with both genotyping methodologies and the breeding values predictors were compared according to their theoretical accuracy (evaluation of the variance of the error in the prediction) and predictive ability (correlation between the phenotype observed and estimated) with respect to conventional predictions. The theoretical accuracy for the prediction models including genomic information was higher with respect to the conventional results and particularly ddRADseq had better performance with those traits with heritability<0.43 (cel20, dap11, dap20, db20). The other traits had almost no differences. In contrast, the predictive ability was very similar for all models, and the conventional method was slightly higher for some traits with heritability <0.43. The molecular breeding strategies applied during this thesis will allow early selection of superior genotypes in the E. dunnii breeding programs by shortening the improvement cycles, in addition providing new markers and candidate genes of interest that can be validated. in other populations and incorporated as information for predictive models.
Fil: Aguirre, Natalia Cristina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.