Ingeniería de la proteína BLS para la construcción de dispositivos nanofotónicos y mediciones estructurales basadas en nanoscopía de fluorescencia

• Autores: Sosa, Santiago
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Goldbaum, Fernando Alberto; Stefani, Fernando Daniel
• Materia: MICROSCOPIAS DE MOLECULA UNICA; CAJA PROTEICA; NANOSCOPIAS; NANO-FABRICACION; BIONANOFOTONICA; SINGLE MOLECULE MICROSCOPIES; PROTEIN CAGE; NANOSCOPY; NANO- FABRICATION; BIONANOPHOTONICS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La fabricación de nanoestructuras a partir de moléculas biológicas es un campo de investigación muy activo. En 2006 se desarrolló un método revolucionario, llamado “Origamis de ADN”, para formar estructuras nanométricas a base de DNA. Diversos trabajos demostraron que estas estructuras podían funcionar como sistemas de andamiaje donde organizar nanopartículas, fluoróforos y proteínas, y las aplicaciones de los origamis de ADN se expanden día a día. Las proteínas pueden aportar una herramienta alternativa y complementaria al campo de la nano- fabricación. En comparación con el ADN, las proteínas tienen la ventaja de poseer mayor rigidez estructural, gran diversidad de funciones químicas y biológicas, y la capacidad de auto-ensamblarse en estructuras de mayor tamaño y complejidad. En este contexto, esta tesis explora la ingeniería de una proteína específica para el diseño de dispositivos nanofotónicos, es decir, estructuras fabricadas en base a proteínas que sirvan para manipular luz e interacciones luz-materia en escala nanométrica. La proteína modelo se llama Lumazina Sintasa de Brucella (o BLS por sus siglas en inglés). La misma es un homo-decámero, ensamblado como dímero de pentámeros. Algunas ventajas de emplearla como bloque de construcción son su alta termoestabilidad y su resistencia frente a desnaturalizantes químicos. Así mismo, sus extremos N-terminales se encuentran libres y disponibles para la fusión con otros polipéptidos así como cualquier otro tipo de moléculas. En primer lugar, aprovechando que el decámero de BLS forma una cavidad que podría albergar pequeñas moléculas, se incorporaron en ella fluoróforos y se caracterizaron sus propiedades ópticas en este entorno. Luego, combinando de manera novedosa dos metodologías de microscopía de molécula única, se caracterizó la movilidad y la orientación relativa de dichos fluoróforos respecto a la proteína. Con este método fue posible determinar que los fluoróforos se ubican en la cavidad en dos orientaciones preferenciales. Es destacable que esta información estructural se obtuvo en un microscopio óptico, a temperatura ambiente, y en entorno líquido, y de hecho se observaron transiciones dinámicas de los fluoróforos entre las dos orientaciones preferenciales. Estos experimentos constituyen avances en dos frentes. Por un lado, los resultados obtenidos demuestran que la nana fabricación por ingeniería de proteínas es una estrategia prometedora y ampliamente aplicable para estudiar las interacciones entre moléculas pequeñas y proteínas, así como una herramienta atractiva para controlar la orientación de los fluoróforos empleando un andamio biológico, allanando el camino para aplicaciones en bionanofotónica que dependen de la orientación molecular. Por otro lado, la metodología desarrollada representa un paso importante en la tendencia actual de obtener información estructural de biomoléculas en condiciones biológicamente relevantes, en incluso de observar dinámicas. En este sentido, en otro capítulo de esta tesis, expandimos este concepto modificando a BLS para aplicar nanoscopías de fluorescencia con resolución nanométrica, y así medir, en condiciones biológicamente relevantes, las dimensiones de la proteína. Otra investigación de BLS como plataforma para dispositivos nanofotónicos fue el ensamblado de sistemas multicromofóricos. Usando la multiplicidad de funcionalidades que ofrece BLS, se incorporaron grupos funcionales de especificidad en un extremo de un pentámero, y fluoróforos en el otro extremo. Este constructo multicromofórico fue evaluado como marcador para microscopía de super-resolución por ubicación de moléculas individuales, con el objetivo de obtener un marcador más eficiente que los tradicionales. Si bien se logró marcar y visualizar actina con BLS por super-resolución, no se hallaron grandes mejorías respecto a otros marcadores existentes o desarrollados en simultáneo con esta tesis. Finalmente, con el objetivo de ensamblar nano-antenas ópticas basadas en BLS, se estudió el ensamblado de nanopartículas de oro sobre los extremos de BLS. Se lograron obtener oligómeros de nanopartículas de oro mediante dos estrategias diferentes que involucran a BLS. Estudios de partícula única revelaron que dichas poblaciones son heterogéneas. Este enfoque requiere de más investigación para obtener protocolos que permitan fabricar nanoantenas con control estequiométrico de proteínas y nanopartículas.
The fabrication of nanostructures from biological molecules is an active field of research. In 2006, a revolutionary method (called “DNA Origamis”), was developed to form nanometric structures based on DNA. Various works demonstrated that these structures could function as scaffolding systems to organize nanoparticles, fluorophores and proteins. The applications of DNA origami are expanding day by day. Proteins can provide an alternative and complementary tool to the field of nanofabrication. Compared to DNA, proteins have the advantage of having more structural rigidity, a great diversity of chemical and biological functions, and the ability to self-assemble into structures of greater size and complexity. In this context, this thesis explores the engineering of a specific protein for the design of nanophotonic devices. In other words, structures manufactured based on proteins that serve to manipulate light and light-matter interactions on a nanometric scale. The model protein is called Brucella Lumazine Synthase (or BLS). It is a homo- decamer, assembled as a dimer of pentamers. Some advantages of using it as a building block are its high thermostability and resistance to chemical denaturants. Likewise, its N-terminal ends are free and available for fusion with other polypeptides as well as any other type of molecules. In first place, taking advantage of the fact that the BLS decamer forms a cavity that could house small molecules, fluorophores were incorporated inside it and their optical properties were characterized in this environment. Then, by combining two single-molecule microscopy methodologies in a novel way, the mobility and relative orientation of these fluorophores with respect to the protein were characterized. With this method it was possible to determine that the dyes are hosted in the cavity in two preferential orientations. It is important to note that this structural information was obtained in an optical microscope, at room temperature, and in a liquid environment, allowing to observe dynamic transitions of the fluorophores between the two preferential orientations. These experiments constitute advances on two fronts. On one hand, the results obtained demonstrate that protein engineering nanofabrication is a promising and widely applicable strategy to study interactions between small molecules and proteins, as well as an attractive tool to control the orientation of fluorophores using a biological scaffold, paving the way for applications in bionanophotonics that depend on molecular orientation. On the other hand, the developed methodology represents an important step in the current trend of obtaining structural information of biomolecules under biologically relevant conditions, even observing dynamic information. In this sense, in another chapter of this thesis, we expand this concept by modifying BLS to apply fluorescence nanoscopy with nanometric resolution, and thus measure the dimensions of the protein under biologically relevant conditions. Another investigation of BLS as a platform for nanophotonic devices was the assembly of multichromophoric systems. Using the multiplicity of functionalities offered by BLS, specificity functional groups were incorporated at one end of a pentamer, and fluorophores at the other end. This multichromophoric construction was evaluated as a marker for super-resolution microscopy by location of individual molecules, with the aim of obtaining a more efficient marker than traditional ones. Although it was possible to mark and visualize actin with BLS by super-resolution, no great improvements were found compared to other existing markers or developed simultaneously with this thesis. Finally, with the aim of assembling optical nano-antennas based on BLS, the assembly of gold nanoparticles oligomers using BLS was studied. Gold nanoparticle oligomers were obtained using two different strategies involving BLS. Single particle studies revealed that these populations were heterogeneous. This approach requires more research to obtain protocols that allow manufacturing nano-antennas with stoichiometric control of proteins and nanoparticles.
Fil: Sosa, Santiago. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.