Cuantificación de constantes de equilibrio a partir de técnicas de nanoscopía de fluorescencia

• Autores: Marcano García, Fernando
• Año de publicación: 2025
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Aramendía, Pedro Francisco
• Materia: MICROSCOPIA DE MOLECULAS INDIVIDUALES; CONSTANTE DE EQUILIBRIO; HIBRIDACION; INTERACCION PROTEINA-PROTEINA; TCR; SINGLE-MOLECULE MICROSCOPY; EQUILIBRIUM CONSTANT; HYBRIDIZATION; PROTEIN-PROTEIN INTERACTION; TCR
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La microscopía de fluorescencia con localización de molécula única (SMLM, por sus siglas en inglés), combinada con superresolución, proporciona las coordenadas moleculares con una precisión de decenas de nanómetros en el plano perpendicular a la propagación de la luz. Esto permite la posibilidad de contar moléculas y correlacionar sus ubicaciones, proporcionando un mapa de las posiciones reales en una imagen de superresolución. Considerando la correlación de pares moleculares como indicativo de interacción, y como una forma de discernirlos de las moléculas libres, describimos un método para cuantificar constantes termodinámicas de equilibrio (K). Mientras que otros métodos experimentales utilizados para estudiar las interacciones en sistemas biológicos y que a menudo operan en solución, que pueden no reflejar con precisión las condiciones celulares, SMLM ofrece la ventaja de que el parámetro de interacción podría potencialmente determinarse en el entorno fisiológico apropiado, como la membrana, el citoplasma celular, las organelas o inclusive en sistemas bifásicos. En este estudio, utilizamos inicialmente dos homo-oligonucleótidos complementarios en solución como sistema de prueba: uno marcado con Cianina 3.5 y el otro con Alexa Fluor 647. Controlamos la hibridación ajustando la cantidad de cada hebra, la temperatura y la fuerza iónica, y medimos la emisión en estado estacionario. Posteriormente, examinamos las mismas muestras en experimentos de Microscopía de Reconstrucción Óptica Estocástica (STORM, por sus siglas en inglés) con detección simultánea de dos colores. Tras confirmar que los valores obtenidos en STORM coincidían con los del experimento en solución, encaramos simulaciones y evaluación de muestras en células fijadas. Para evaluar concentraciones, evaluamos el área o volumen que contiene a las moléculas por métodos de teselaciones de Delaunay y Voronoi, así como por una función de distribución de densidad de kernel (ks-density). Así podemos calcular K en concentraciones a partir de distribuciones moleculares. Los estudios de simulación validan la precisión de nuestro método en diversas condiciones de densidad y afinidad. Además, también se evaluaron varios datos de literatura. Aplicando esta técnica a proteínas señalizadoras de linfocitos T, mediante Microscopía de Acumulación de Puntos de ADN para Imagen en Topografía a Nanoescala (DNA-PAINT), determinamos la constante de asociación en la membrana celular de los receptores de células T (TCR) en células en reposo. En este mismo sistema, evaluamos la constante de disociación pseudo-3D de las moléculas citoplasmáticas pZAP70, unidas a los sitios de tirosina fosforilada en el complejo TCR-pCD3ζ en la membrana de células T. Varios escenarios de asociación arrojan valores similares de K para el heterodímero, lo que ofrece información sobre los mecanismos de activación de las células inmunitarias. Además, abordamos desafíos como el efecto de la detección múltiple, estimación del espacio que contiene a las especies, la eficiencia de etiquetado-detección molecular y la determinación de la distancia crítica para la asociación. Este método cuantifica las interacciones de las proteínas en los entornos celulares, avanzando en nuestro conocimiento sobre procesos biológicos complejos.
Fluorescence Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM), together with super resolution techniques provides molecular localization with a precision of tens of nanometres in the plane perpendicular to light propagation. This enables the possibility of counting molecules and correlating their locations, providing a map of the actual molecular positions in a super- resolution image. Considering the correlation of molecular pairs as indicative of interaction, and as a way to distinguish them from free molecules, we describe a method to quantify thermodynamic equilibrium constants (K). While other experimental methods used to study interactions in biological systems, often operating in solution, may not accurately reflect cellular conditions, SMLM offers the advantage that the interaction parameter could potentially be determined in the appropriate physiological environment, such as the membrane, the cellular cytoplasm, organelles or even biphasic systems. In this study, we initially used two complementary homo-oligonucleotides in solution as a test system: one labelled with Cy3.5 and the other with Alexa Fluor 647. We controlled hybridization by adjusting the amount of each strand, temperature, and ionic strength, and measured steady-state emission. Subsequently, we examined the same samples in Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM) experiments with simultaneous two colours detection. After confirming that the values obtained in STORM matched those from the solution experiment, we conducted simulations and sample evaluation in fixed cells. To assess concentrations, we evaluated the area or volume containing the molecules by Delaunay and Voronoi tessellation methods, as well as a kernel surface density function (ks-density). Thus, we can calculate K at different concentrations from molecular distributions. Simulation studies validate the accuracy of our method under various density and affinity conditions. Additionally, several literature data were also evaluated. Applying this technique to T cell signalling proteins, using DNA Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography (DNA-PAINT), we determined the association constant of T cell receptors (TCRs) on the cell membrane of resting cells. In this same system, we evaluated the pseudo-3D dissociation constant of pZAP70 molecules in the cytosol, bound to the phosphorylated tyrosine sites in the TCR-pCD3ζ complex on the T cell membrane. Various association scenarios yielded similar K values for the heterodimer, providing insight into immune cell activation mechanisms. Furthermore, we addressed challenges such as the effect of multiple detection, estimation of the space that contains the species, molecular labeling- detection efficiency and the determination of the critical distance for association. This method quantifies protein interactions in cellular environments, advancing our understanding of complex biological processes.
Fil: Marcano García, Fernando. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.