Análisis genético y bioquímico del metabolismo del poli(3-hidroxibutirato) (PHB) en Bacillus megaterium

• Autores: Vazquez, Gustavo
• Año de publicación: 1999
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Méndez, Beatriz Silvia
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las estrategias para poder clonar los genes involucrados en la síntesis, movilización ometabolismo del PHB en otras especies bacterianas abarcan 3 tipos: I) Complementación de cepas que no poseen actividad de alguna de las enzimas queintervienen en el camino biosintético del polímero. II) Hibridización de ácidos nucleicos utilizando sondas heterólogas de la zona conservada . III) Secuenciación directa de las proteínas de gránulo y construcción de sondas homólogas. Durante el desarrollo de mi tesis de investigación utilicé la estrategia de lasecuenciación directa de las proteínas de gránulos. Para lograr esto era necesario saber quetipo de proteínas están asociadas al gránulo y comparar su patrón de corrida en PAGE con lospatrones de corrida de otras especies y establecer cual era la probable PHB sintasa. El patrónde proteínas mostró 3 bandas intensas en el gel: una proteína de 22 kDa que cuyo extremoaminoterminal ya había sido secuenciado (Steinbüchel, dato no publicado). Está sería laproteína estructural de gránulo (fasina); las otras dos bandas son de proteínas de 40 kDa y 43kDa. En cambio la proteína de 40 kDa, sería la PHB sintasa, debido a que se encuentra engran cantidad el momento de recolección de las bacterias para analizar su patrón de proteínas,fue el de mayor acumulación de PHB. Por lo tanto procedí y logré el secuencimiento delextremo aminoterrninal de dicha proteína. Con las secuencias de las proteínas de 22 kDa y 40 kDa, diseñé dos sondas y con ellasrealicé estudios de Southern tanto sobre ADN genómico como sobre plásmidos que contienengenes clonados de B. megaterium que intervienen en el metabolismo del PHB. Con estosexperimentos se detectó un segmento de ADN cromosómico de B. megaterium que hibridabacon la sonda de fasina. Cuando se secuenció este fragmento se descubrió que contiene 3 genesque estuvieron involucrados en la transactivación de la Tiolasa II de E. coli. Dos de dichos genes mostraron, por comparación con secuencias proteínas ysecuencias de ADN de los bancos de datos, que tenían una gran homología con un par deproteínas sensor-activador involucradas en la regulación del operón ato de E. col mediada porel complejo σ54 holoenzima RNA polimerasa. También mostraron una gran homología conotro activador de B. subtilis dependiente de σ54.El tercer gen mostraba homología con el genpbt que codifica para la enzima Fosfobutiril transferasa (Pbt) en C. acetobutuylícum. Losanálisis de la actividad enzimática de esta posible enzima Pbt de B. megaterium mostraron unpatrón de expresión complejo: l) Sufre represión catabólica 2) Su pico de expresión se encuentra en el principio de la fase estacionaria 3) Se aumenta la expresión de este gen por la presencia de los aminoácidos valina,leucina e isoleucina. Finalmente, mediante experimentos de expresión en E. coli, tanto de la enzima Pbtcomo del activador dependiente de σ54 clonados de B. megaterium, corroboré que dichoactivador está involucrado en la transcripción del gen pbt.
Fil: Vazquez, Gustavo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.