Estudio de la proteína FGD6 como un nuevo regulador de la organización dinámica del citoesqueleto de actina neuronal

• Autores: Galván, Daniela Inés
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: García, Corina Ileana; Castaño, Eduardo Miguel
• Materia: FGD6; NEURONA; RHO GTPASAS; CITOESQUELETO; ACTINA; FGD6; NEURON; RHO GTPASES; CYTOSKELETON; ACTIN
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

En el Sistema Nervioso Central (SNC), procesos biológicos esenciales en las neuronas, como la morfología y la sinaptogénesis, requieren de la remodelación del citoesqueleto de actina. La misma es coordinada por Rho GTPasas (RhoA, Rac1 y Cdc42), que oscilan entre un estado activo con GTP y uno inactivo con GDP mediados por GEFs y GAPs con localización y actividad específicas. FGD6, sin función conocida en SNC, pertenece a una familia de proteínas con una organización estructural que le permitiría actuar como nexo entre la membrana plasmática y el citoesqueleto de actina. Recientemente se describió una asociación de FGD6 con Cdc42 y Rac1. El objetivo general de esta tesis es estudiar la relevancia funcional de FGD6 y su posible participación regulando el citoesqueleto neuronal. Nuestra hipótesis es que, en las neuronas, FGD6 modularía la actividad de las Rho GTPasas fundamentales en la reorganización del citoesqueleto de actina y, por lo tanto, de procesos tales como la diferenciación, la polarización y la neuritogénesis. Los estudios in silico de la estructura terciaria determinaron que la región N-terminal de FGD6 es intrínsecamente desordenada, con mayor probabilidad de interactuar con otros dominios/ proteínas ordenadas y conteniendo varios sitios de fosforilación. La expresión del ARNm de FGD6 mostró una regulación durante la diferenciación neuronal in vitro. La inhibición parcial de FGD6 produjo un aumento significativo en la actividad basal de Rac1, sugiriendo que FGD6 estaría modulando negativamente a esta GTPasa y consecuentemente, a las proteínas efectoras ubicadas río abajo de la vía. Rac1 activa una cascada de fosfo/desfosforilaciones que incluye a PAK, LIMK y Cofilina, que finaliza con la polimerización de los monómeros de actina y la regulación del turnover de los filamentos de actina. El complejo Arp2/3 es indispensable para generar las ramificaciones de actina, siendo las subunidades Arp2 y Arp3 los principales actores del complejo nucleador. Con el silenciamiento de FGD6 no se observaron diferencias en los niveles de fosforilación de Cofilina ni de LIMK1, ni en los niveles de Arp3 pero sí de Arp2 (sin cambios en su ARNm). La interferencia de FGD6 produjo además alteraciones morfológicas en las células y una disminución drástica en la marcación de actina filamentosa (F-actina), sin cambios en el contenido total de actina. Así, la hiperactividad de Rac1, la modificación de la estequiometria del complejo Arp2/3 y de la F-actina, podrían impactar en la regulación de la correcta función neuronal. Mutaciones en FGD6 se asocian con degeneración macular, autismo y epilepsia. El Neuroepitelio generado a partir de células pluripotentes inducidas de pacientes con Epilepsia Focal Autolimitada de la Infancia (SFEC) presentó una acumulación anómala de la proteína en el citoplasma y la membrana plasmática. Los fibroblastos de los pacientes presentaron el citoesqueleto de actina alterado, similar a lo descripto con el silenciamiento; recapitulando los hallazgos in vitro y acompañando la hipótesis de que FGD6 mutado en SFEC ha perdido/disminuido su función, afectando el citoesqueleto y perturbando la actividad neuronal, como se reportó previamente. En conclusión, la expresión de FGD6 se encuentra finamente regulada en las neuronas y su inhibición afecta vías intracelulares que impactan en el citoesqueleto de actina, pudiendo así alterar la función celular. Los resultados presentados en esta Tesis permiten comenzar a esclarecer el mecanismo por el cual FGD6 modula vías de señalización de Rac1, pudiendo ser de manera directa y/o indirecta, a través de factor(es) que interacciona(n) con los distintos componentes de las mismas. Finalmente, los resultados obtenidos ayudan a comprender la posible contribución de FGD6 a la fisiopatología de enfermedades neurológicas como la SFEC.
In the Central Nervous System (CNS), essential biological processes in neurons, such as morphology and synaptogenesis, involve remodeling of the actin cytoskeleton. These cytoskeletal rearrangements are coordinated by Rho GTPases (RhoA, Rac1 and Cdc42) which act as switches cycling between active (GTP-bound) and inactive (GDP-bound) states mediated by GEFs and GAPs with specific location and activity. FGD6 belongs to a family of proteins with multidomain organization that may function as signaling scaffold between plasma membrane and the actin cytoskeleton. Although FGD6 is expressed in neurons, its function is not established and the association with Cdc42 and Rac1 was recently described. The aim of this thesis is to study the functional relevance of FGD6 and its potential role regulating neuronal cytoskeleton. Our hypothesis is that, in neurons, FGD6 would modulate the activity of key Rho GTPases for actin cytoskeleton reorganization and, therefore, processes such as differentiation, polarization and neuritogenesis. In silico studies of FGD6 tertiary structure determined that the N-terminal region is intrinsically disordered, most likely to interact with other ordered domains/proteins, and containing several phosphorylation sites. We observed a modulation of FGD6 expression during neuronal differentiation in vitro. FGD6 knockdown results in Rac1 basal activation, suggesting that FGD6 would negatively modulate this GTPase and, consequently, its downstream effector proteins. Rac1 activates a cascade of phospho/dephosphorylations that includes PAK, LIMK and Cofilin, which ends with the polymerization of actin monomers and the regulation of actin filament turnover. The ARP2/3 complex is essential for actin filament branching, being Arp2 and Arp3 subunits the main actors of the nucleator complex. In FGD6 knockdown conditions no differences were observed neither in Cofilin or LIMK1 phosphorylation nor in Arp3 levels. However, a decrease in FGD6 expression resulted in a significant reduction in Arp2 protein levels (without affecting its mRNA), along with changes in cell morphology and a decrease in F-actin staining, with no modification of total actin pool. Therefore, Rac1 hyperactivity, the imbalance of Arp2/3 complex stoichiometry and F-actin disassembly, could impact in proper neuronal function. FGD6 mutations are associated with macular degeneration, autism, and epilepsy. In Neuroepithelium generated with induced pluripotent cells from Self-limited Focal Epilepsy of Childhood (SFEC) patients, we observed an abnormal protein accumulation in the cytoplasm and the plasma membrane. Fibroblasts from these patients displayed an altered actin cytoskeleton, similar to FGD6 knockdown experiments; recapitulating in vitro observations and supporting the hypothesis that FGD6 mutation in SFEC may induce loss/decreased protein function, thus affecting cytoskeleton and impairing neuronal activity previously reported in these patients. In conclusion, FGD6 expression is tightly regulated in neurons and its inhibition affects intracellular pathways that impact on actin cytoskeleton, which may in turn hamper neuronal functions. The results presented in this Thesis contribute to shed some light on the mechanism by which FGD6 modulates Rac1 signaling pathways, directly and/or indirectly, through factor(s) that interact(s) with different components along the axis. Finally, the results described here contribute to understand FGD6 potential involvement in the pathophysiology of neurological diseases such as SFEC.
Fil: Galván, Daniela Inés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.