Estudio de la proteína FGD6 como un nuevo regulador de la organización dinámica del citoesqueleto de actina neuronal - Galván, Daniela Inés (2023)
En el Sistema Nervioso Central (SNC), procesos biológicos esenciales en las neuronas, como la morfología y la sinaptogénesis, requieren de la remodelación del citoesqueleto de actina. La misma es coordinada por Rho GTPasas (RhoA, Rac1 y Cdc42), que oscilan entre un estado activo con GTP y uno inactivo con GDP mediados por GEFs y GAPs con localización y actividad específicas. FGD6, sin función conocida en SNC, pertenece a una familia de proteínas con una organización estructural que le permitiría actuar como nexo entre la membrana plasmática y el citoesqueleto de actina. Recientemente se describió una asociación de FGD6 con Cdc42 y Rac1. El objetivo general de esta tesis es estudiar la relevancia funcional de FGD6 y su posible participación regulando el citoesqueleto neuronal. Nuestra hipótesis es que, en las neuronas, FGD6 modularía la actividad de las Rho GTPasas fundamentales en la reorganización del citoesqueleto de actina y, por lo tanto, de procesos tales como la diferenciación, la polarización y la neuritogénesis. Los estudios in silico de la estructura terciaria determinaron que la región N-terminal de FGD6 es intrínsecamente desordenada, con mayor probabilidad de interactuar con otros dominios/ proteínas ordenadas y conteniendo varios sitios de fosforilación. La expresión del ARNm de FGD6 mostró una regulación durante la diferenciación neuronal in vitro. La inhibición parcial de FGD6 produjo un aumento significativo en la actividad basal de Rac1, sugiriendo que FGD6 estaría modulando negativamente a esta GTPasa y consecuentemente, a las proteínas efectoras ubicadas río abajo de la vía. Rac1 activa una cascada de fosfo/desfosforilaciones que incluye a PAK, LIMK y Cofilina, que finaliza con la polimerización de los monómeros de actina y la regulación del turnover de los filamentos de actina. El complejo Arp2/3 es indispensable para generar las ramificaciones de actina, siendo las subunidades Arp2 y Arp3 los principales actores del complejo nucleador. Con el silenciamiento de FGD6 no se observaron diferencias en los niveles de fosforilación de Cofilina ni de LIMK1, ni en los niveles de Arp3 pero sí de Arp2 (sin cambios en su ARNm). La interferencia de FGD6 produjo además alteraciones morfológicas en las células y una disminución drástica en la marcación de actina filamentosa (F-actina), sin cambios en el contenido total de actina. Así, la hiperactividad de Rac1, la modificación de la estequiometria del complejo Arp2/3 y de la F-actina, podrían impactar en la regulación de la correcta función neuronal. Mutaciones en FGD6 se asocian con degeneración macular, autismo y epilepsia. El Neuroepitelio generado a partir de células pluripotentes inducidas de pacientes con Epilepsia Focal Autolimitada de la Infancia (SFEC) presentó una acumulación anómala de la proteína en el citoplasma y la membrana plasmática. Los fibroblastos de los pacientes presentaron el citoesqueleto de actina alterado, similar a lo descripto con el silenciamiento; recapitulando los hallazgos in vitro y acompañando la hipótesis de que FGD6 mutado en SFEC ha perdido/disminuido su función, afectando el citoesqueleto y perturbando la actividad neuronal, como se reportó previamente. En conclusión, la expresión de FGD6 se encuentra finamente regulada en las neuronas y su inhibición afecta vías intracelulares que impactan en el citoesqueleto de actina, pudiendo así alterar la función celular. Los resultados presentados en esta Tesis permiten comenzar a esclarecer el mecanismo por el cual FGD6 modula vías de señalización de Rac1, pudiendo ser de manera directa y/o indirecta, a través de factor(es) que interacciona(n) con los distintos componentes de las mismas. Finalmente, los resultados obtenidos ayudan a comprender la posible contribución de FGD6 a la fisiopatología de enfermedades neurológicas como la SFEC.