Diheteroariletenos fluorescentes como sondas para microscopía de fluorescencia

• Autores: Gillanders, Florencia
• Año de publicación: 2016
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Jovin, Thomas M.
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las técnicas modernas de microscopía de fluorescencia requieren sondas cuyoscomportamientos fotoquímicos, combinados con las características ópticas del equipamiento,permitan resolver estructuras de dimensiones menores al límite impuesto por la difracciónnatural de la luz. Además de ser brillantes, estables, pequeñas y compatibles con el mediobiológico, las sondas ideales fluorescen y se tornan oscuras de manera controlada y conocida. En esta tesis se diseñaron nuevas sondas basadas en los diheteroariletenos oxidados (DHAOs)como plataforma de fluorescencia controlada. Los DHAOs son compuestos fotocrómicos que presentan dos isómeros fotoestables, unofluorescente y uno oscuro, alcanzados por irradiación con luz ultravioleta y visiblerespectivamente. Las propiedades espectroscópicas de los DHAOs se optimizaron estudiandoel efecto de sustituyentes dadores y aceptores de electrones sobre las mismas. La demandantecaracterización espectrofotométrica de los DHAOs se abordó con un espectrofotómetro yfotomodulador de construcción propia, el cual permitió automatizar las mediciones y explorarsistemáticamente diferentes condiciones de fotoconversión. Se descubrió que al aumentar elcarácter dador de electrones del sustituyente, se estabiliza particularmente el estado excitadodel isómero fluorescente, resultando en un aumento del desplazamiento de Stokes y unpronunciado solvatocromismo del fluoróforo. El solvatocromismo se utilizó para estudiar elcambio de polaridad del entorno de monómeros de α-sinucleína durante su agregación. A fin de conservar la fluoresencia fotomodulable de los DHAOs en agua, se explorarondiversas estrategias de solubilización con modificaciones covalentes y no-covalentes. Lainclusión en cavidades de ciclodextrina, la adsorción a albúmina, y la funcionalización congrupos hidrofílicos sirvieron para solubilizar efectivamente a los DHAOs en medios acuosos. Las propiedades de fluorescencia y fotoconversión se retuvieron exitosamente dentro de lacavidad de las proteínas de unión de ácidos grasos y mediante la conjugación a entidadesprotéicas de mayor tamaño, indicando la preferencia de los DHAOs a un entorno protegido delagua. Anticuerpos secundarios conjugados a DHAOs se utilizaron para marcar β-tubulinaen neuronas, y se lograron fotoconvertir selectivamente distintas áreas de las muestras enun microscopio que incorpora un arreglo programable para generar patrones espaciales deexcitación. El particular comportamiento fotoquímico de los diheteroariletenos permitió desarrollar unaestrategia para aumentar la resolución microscópica combinando DHAOs con fotocrómicosno-fluorescentes. Utilizando el fenómeno de transferencia de energía por resonancia de Förster, se postulan sondas que requieren de múltiples estímulos para la activación de laemisión, disminuyendo el volúmen de activación por debajo del límite de difracción de laluz y aumentando la resolución axial. La aplicación de las sondas sintetizadas y la propuestade nuevas estrategias relacionadas con los DHAOs denotan el potencial que tienen los mismosen la búsqueda de mayor resolución en la microscopía de fluorescencia.
Modern fluorescence microscopy techniques require probes whose photochemical behaviour,combined with the optical characteristics of the microscope, enable the resolution of structuressmaller than the natural diffraction limit of light. In addition to being bright, stable, small andcompatible with the biological environment, the ideal probe’s fluorescence is activated anddeactivated in a controlled and predictable manner. New probes were designed using oxidizeddiheteroarylethenes (ODHAs) as a platform for controlled fluorescence and are presented inthis thesis. ODHAs are photochromic compounds with two photostable isomers, one fluorescent andone dark, which are formed upon irradiation with ultraviolet and visible light, respectively. In order to optimize their spectroscopic and photochemical properties, the ODHAs weremodified with electron-donating and -withdrawing substituents. The demanding spectroscopiccharacterization of the photochromes was tackled with a custom built spectrophotometerand photoconverter, which enabled automatization of the measurements and the systematicexploration of varying photoconversion conditions. By increasing the electron-donatingcharacter of the substituents, the excited state of the fluorescent isomer is particularlystabilized, resulting in an increase in the Stokes shift and pronounced solvatochromism ofthe fluorophore. The solvatochromic ODHA was used to probe the changes in local polarityaround monomers of the amyloid protein α-synuclein during their aggregation. Diverse solubilization strategies involving both covalent and non-covalent modificationswere employed with the aim of conserving the photoswitchable fluorescence of ODHAs inwater. Inclusion in cyclodextrin cavities, adsorption onto albumin, and functionalization withhydrophilic groups all served to effectively solubilize the ODHAs in aqueous solutions. Thefluorescence and photoconversion properties were conserved inside the cavities of fatty acidbinding proteins and by conjugation to larger protein entities, indicating the preference ofthe ODHAs for surroundings devoid of water. Secondary antibodies conjugated to ODHAswere used to immunostain β-tubulin in fixed neurons, and different areas of the samplewere selectively photoconverted using structured illumination with a structured illumination (programmable array) microscope. A new strategy for increasing microscopic resolution was developed, harnessing the uniquephotochemical behaviour of diheteroarylethenes by combining ODHAs with non-fluorescentphotochromes. The proposed probes require multiple stimuli for activation of the Försterresonance energy transfer-modulated emission, reducing the activation volume below thediffraction limit and increasing axial resolution. The application of the synthesized probesand the description of novel strategies related to ODHAs denote their potential in the searchfor increased resolution in fluorescence microscopy.
Fil: Gillanders, Florencia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.