Regulación de fosfodiesterasa y quinasas de proteínas en Trypanosoma cruzi

• Autores: Ulloa de la Serna, Rita María
• Año de publicación: 1988
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Tellez Iñon, María Teresa
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

En este trabajo de Tesis se describen y caracterizan algunasde las enzimas directamente involucradas en el metabolismodel AMPc del protozoario parásito Trypanosoma cruzi, agente etiológicode la Enfermedad de Chagas. Diversos autores han postuladoque el AMP cíclico regula la diferenciación del parásito. Si bienno se conoce su blanco de acción intracelular, se demostró quelos niveles endógenos del AMP cíclico aumentan durante la metaciclogénesis. Los resultados presentados indican la existencia deuna quinasa de proteinas dependiente de AMPc en el parásito, queprobablemente sea la mediadora de muchos de los efectos del nucleótido. Extractos citosólicos de la forma epimastigote de T. cruzicromatografiados en una columna de DEAE-celulosa mostraron dospicos con actividad de quinasa de proteínas que eluyeron a 0,15 y 0,32 M NaCl, respectivamente. El segundo pico, PKII, también presentócapacidad de unir AMPc en forma específica y se activó porconcentraciones nanomolares del nucleótido. La actividad de quinasa de proteinas dependiente de AMPC (PKII) se purificó por filtración en geles, por cromatografía deafinidad en histona-Sepharosa y en AMPc-agarosa y por cromatografíaen una columna mixta de Sephadex G-25-Carboximetil Sephadex C-50. La enzima pudo disociarse parcialmente en dos componentesdiferentes: catalítico y regulatorio. El componente catalíticopresentó un radio de Stokes (2,2 nm) menor que el de la subunidadcatalítica de corazón bovino (2,8 nm). En experimentos de reconstitución,la actividad del componente catalítico de T. cruzi seinhibió por la subunidad regulatoria de corazón. A su vez, elcomponente regulatorio fue capaz de inhibir la actividad fosfotransferasadel componente catalítico homólogo y de la subunidadcatalítica de corazón. Estas inhibiciones se revirtieron con laadición de AMPc. La preparación de holoenzima se fosforiló en ausencia deun sustrato exógeno aceptor de fosfatos y se analizó en electroforesisen condiciones disociantes. Se observó una única bandafosforilada de 56 K. La misma preparación se transfirió a nitrocelulosay se incubó con anticuerpos policlonales contra la subunidadregulatoria tipo II de eucariotes superiores (Westernblot). El antisuero reconoció una única banda de 56 K. Se puede concluir que la quinasa dependiente de AMPc delparásito es similar a una quinasa tipo II de mamíferos en base alas siguientes características: elución con alta sal de una DEAE-celulosa,tamaño de la subunidad regulatoria, capacidad de autofosforilarsede la misma y el reconocimiento por sueros policlonalesespecificos contra RII. En la segunda parte de este trabajo se estudió la fosfodiesterasade nucleótidos cíclicos (PDE) obtenida de extractos citosólicosdel parásito. La enzima soluble (80%) se purificó por DEAE-celulosa y por cromatografía de afinidad en calmodulina-Sepharosa. La PDE que eluyó en un único pico de la DEAE-celulosahidrolizó AMPc y GMPc con alta afinidad. La enzima se activó enpresencia de la calmodulina homóloga, de cerebro bovino y de N.crassa, logréndose el 50% de estimulación máxima con 0,3 μg/mldel activador. En un gráfico de dobles recíprocas, la enzima presentódos componentes cinéticos, uno de alta y otro de baja afinidadpor el sustrato AMPc (Km 2,5 y 100 μM). La calmodulinaaumentó la Vmáx de ambos componentes sin modificar la afinidad dela enzima por el sustrato. La activación requirió concentracionesmicromolares de Ca²+ y se bloqueó por EGTA y por drogas neurolépticascomo la clorpromazina, la flufenazina y el compuesto 48/80. Paralelamente se purificó la calmodulina del parásito por DEAE-celulosa, filtración en geles y cromatografía de afinidad en CAPP-Sepharosao en Phenyl-Sepharosa. En electroforesis en condicionesdisociantes, la calmodulina mostró una sola banda polipeptídicacon un peso molecular aparente de 16 K. La calmodulina purificadafue capaz de activar la PDE dependiente del activador decerebro bovino en forma similar a la homóloga. La calmodulina, probablemente regule el movimiento flagelarporque el tratamiento in vivo de epimastigotes de T. crusicon drogas fenotiazínicas detuvo el movimiento del parásito y modificósu forma. Este efecto, altamente citotóxico de las drogas,es potencialmente importante y podría utilizarse para una futuraacción terapéutica cuyo blanco sería la calmodulina o las enzimasdependientes del activador. Se puede concluir que en T. cruzi se han conservado lasenzimas implicadas en el metabolismo del AMPc que poseen característicassimilares a las de los eucariotes superiores.
Fil: Ulloa de la Serna, Rita María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.