Caracterización molecular y bioquímica de una nueva proteína quinasa de Trypanosoma cruzi

• Autores: Pascuccelli, Verónica
• Año de publicación: 1997
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Parodi, Armando José
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

En los organismos eucariotas, la regulación de las complejas interaccionesrequeridas para la diferenciación y proliferación, está mediada en parte porlos sistemas de fosforilación de proteínas. En Trypanosoma cruzi, se hanpodido caracterizar varias vías de transducción de señales a partir de laidentificación y caracterización de sus distintos componentes comoproteínas quinasas (PKA, PKC, Cam quinasa, CDK), adeninililciclasa (AC) yproteína G, entre otros. Dentro de la familia de las serina/treonina quinasas,recientemente ha sido identificada una nueva subfamilia de quinasas Llamadas RAC o PKB, cuya principal característica radica en la similitud deidentidad que existe a nivel de su secuencia aminoacídica con PKA y PKCpor igual. Estas proteínas han sido identificadas en células de mamíferos, Drosophila melanogaster, Caenorabhditis elegans, Dyctiostelium discoideumy Entamoeba histolytica pero no han sido aún detectadas en ningúntripanosomátido. Por lo tanto, nos hemos propuesto clonar el o los genesque codifican para esta nueva proteína quinasa en T. cruzi, para suposterior caracterización molecular y bioquímica y si es posible dilucidarsu probable rol in vivo. Como resultado, hemos clonado el gen que codificapara una proteína quinasa RAC homóloga (PKTc), cuyo tamaño es de 1287pb y codifica para una proteína de 428 aminoácidos. Esta proteína mostrótener entre un 60 y un 70% de homología con otras RAC quinasas. La PKTcrecombinante es capaz de fosforilar a la histona IIAS, y de autofosforilarse,fosforilando específicamente residuos de treonina en ambos casos. Utiliza ATP como dador de fosfatos, requiere exclusivamente Mn²+ para suactividad, su valor de pH óptimo es entre 6-8 y su temperatura óptima esde 37°C. El Km aparente para el ATP resultó ser de 1.6 μM. La presencia dediferentes activadores (Ca²+/Cam) o inhibidores (PKI, H7, GF, staurosporina)no mostró tener un efecto significativo sobre su actividad. Experimentos de inmunolocalización utilizando anticuerpos contra laproteína recombinante, demostraron que la enzima se encuentra anclada enla membrana posiblemente, a través de ácido palmítico. Por otro lado, através de experimentos de Western blot pudimos establecer que la PKTcestá presente en los estadios de amastigote, epimastigote y tripomastigotemetacíclico sin mostrar un patrón de expresión diferencial, que demuestraque esta proteína sería de carácter constitutivo. Experimentos deinmunoprecipitación nos permitirán en el futuro, identificar otras proteínasque interactúan con PKTc in vivo y dilucidar así la vía de transducción deseñales en la que PKTc estaría involucrada.
In eucariotes, the regulation of the complex interactions required fordifferentiation and proliferation, is partially control by proteinphosphorylation. The characteristics of several signal transductionpathways have been described in Trypanosoma cruzi from thedentification and characterization of several components such as proteintinases (PKA,PKC, Cam kinase, CDK), adenylyl cyclase (AC), protein G. Recently, a new subfamily of serine/threonine kinases have beenidentified, called RAC or PKB, which are closely related to PKC and PKAfamilies at their aminoacidic sequences. This proteins have been identifiedin mammals cells, Drosophila melanogaster, Caenorabhditis elegans, Dyctiostelium discoideum and Entamoeba histolytica but they haven’t beendetected yet in trypanosomatids. So, our objective was the cloning of thegene/s that codifies for these new protein kinase in T. cruzi, its latercharacterization at the molecular and biochemical level and if it’s possible,elucidate its function in vivo. As results, we cloned the gene that codifiesfor a protein kinase RAC homolog (named PKTc), with an open readingframe of 1287 pb that corresponds to a protein of 428 aminoacids long. This protein shares 60-70% homology with other RAC proteins. Therecombinant PKTc can phosphorylate histone IIAS and itself, in both cases,exclusively in threonine residues. Uses ATP as phosphate donor, requires Mn²+ exclusively for its activity, the optime pH is neutral (6-8) and theoptime temperature is 37°C. The apparent Km for the ATP is 1.6 μM. Thepresence of different activators (Ca²+/Cam) or inhibitors (GF, H7,staurosporine, PKI) did not affect the kinase activity significatly. Experiments of inmunolocalization using antibodies against therecombinant enzyme showed that PKTc is anchored to a membraneprobably by a palmitic acid. Western blots experiments were done in orderto investigate the differential expression of PKTc during the differentstages of the life cycle of T. cruzi. The results demonstrated that thisenzyme is present in the 3 stages (amastigote, epimastigote, metacyclictrypomastigote), without a differential expression pattern, so we supposedthat it’s a constitutive protein. In the future, inmunoprecipitationexperiments will allow us to identified other proteins that could interactedwith PKTc in vivo and elucidate the signal transduction pathway in whichthis enzyme is involved.
Fil: Pascuccelli, Verónica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.