Estudio de aislamientos nacionales y desarrollo de una vacuna a subunidad, direccionada a células presentadoras de antígenos, para el Virus de la Lengua Azul

• Autores: Legisa, Danilo Mario
• Año de publicación: 2014
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Dus Santos, María José
• Materia: VIRUS DE LA LENGUA AZUL; EPIDEMIOLOGIA; VACUNAS RECOMBINANTES; BLUETONGUE VIRUS; EPIDEMIOLOGY; RECOMBINANT VACCINES
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La Lengua Azul es una enfermedad que afecta principalmente rumiantes salvajes ydoméstico, y representa una importante barrera para el comercio internacional de animales y sussubproductos. El Virus de la Lengua Azul es el causante etiológico de la enfermedad y estransmitido por insectos hematófagos del género Culicoides. El Virus de la Lengua Azul , es elmiembro prototipo del género Orbivirus dentro de la familia Reoviridae. El virión está compuestopor una doble capa proteica desnuda que envuelve un genoma de 10 segmentos lineales de ARNdc, los cuales codifican para al menos diez proteínas, 7 proteínas estructurales y al menos 4 noestructurales. La distribución del Virus de la Lengua Azul es global aunque en ciertas zonas la informaciónes escasa. En Sudamérica, evidencia serológica de la presencia del virus fue encontrada todos lospaíses menos Uruguay y Bolivia. Argentina y Brasil son los únicos países donde ha sido aislado elvirus. En Argentina han sido obtenidos 5 aislamientos de Virus de la Lengua Azul serotipo4 enganado bovino. Tres de estos aislamientos fueron logrados entre los años 1999-2001, mientras losdos restantes fueron obtenidos en los años 2009 y 2010 como parte del presente trabajo de tesis. La medida de control más práctica y eficaz es la inmunización profiláctica de los animalessusceptibles. Desde principios del siglo XX se han desarrollado vacunas atenuadas e inactivadaseficientes para la Lengua Azul. Sin embargo, las desventajas en cuanto a bioseguridad y efectosadversos impulsan el desarrollo de vacunas a subunidad, no infecciosas como alternativa a lasvacunas convencionales. En este trabajo de tesis se abordó un análisis epidemiológico molecularde los aislamientos argentinos del VLA y el desarrollo de una vacuna a subunidad direccionada acélulas presentadoras de antígeno. El análisis epidemiológico molecular se basó en la obtención y análisis de las secuencias de 5 de los 10 segmentos virales (Segmentos 2, 3, 6, 7 y 10). El análisis de los segmentos 2 y 6 resultóen un cluster de secuencias argentinas dentro del clado del serotipo 4 y también dentro del grupodel nucleotipo A (definido para cada segmento). El análisis de los segmentos 3, 7 y 10 mostró quelos aislamientos argentinos agrupan dentro del cluster de aislamientos de topotipo occidental owestern, indicando que su origen se remontaría a África/Europa. El análisis filogenético reveló que,además de este origen, las secuencias argentinas representaron un fuerte linaje Sudamericano de evolución independiente. El desarrollo de la vacuna a subunidad se basó en la expresión de la proteína VP2, mayoritaria de la cápside externa e inmunodominante, sola o fusionada a la molécula APCH (Antigen Presenting Cell Homing) capaz de dirigir moléculas a células presentadoras de antígeno,utilizando el sistema de expresión de baculovirus. Los ensayos de inmunogenicidad en cobayos y bovinos utilizando estos dos antígenos, resultaron en altos títulos de anticuerpos neutralizantessimilares a los evocados por la vacuna formulada con virus inactivado. Más aún, se obtuvieron títulos comparables para VP2 y dosis 4 veces menores de APCH-VP2 demostrando la capacidad APCH de potenciar la generación de anticuerpos. Como caracterización de la respuesta inmuneasociada se analizó el perfil de inmunoglobulinas G y la presencia de células T de memoria. El perfilde IgG en los bovinos inmunizados con APCH-VP2 mostró una mayor proporción de IgG1 encomparación con los grupos vacunados con VP2 sola o con el virus inactivado. Por otro lado, lainmunización con las vacunas experimentales, mostró generación de células T de memoria para VP2 sola. Además, se comprobó la capacidad de las vacunas recombinantes de diferenciasanimales vacunados de infectados. Esta sección constituye un aporte en el desarrollo de vacunas asubunidad, capaces de generar una respuesta inmune comparable a vacunas inactivadas pero concaracterísticas emergentes.
Bluetongue disease affects principally wild and domestic ruminants and represents amajor barrier to animal trade and their sub products. The etiological agent is the Bluetongue Virus,it is transmitted by hematophagous arthropods from the genus Culicoides. Bluetongue Virus is theprototype member of genus Orbivirus and it belongs to Reoviridae family. The non envelopedvirión is composed by two concentric protein layer which contents the viral genome, composed byten dsRNA segments. This genome codifies for 7 structural proteins and at least, 4 non structural proteins. Bluetongue Virus is worldwide distributed, although there is a lack of information incertain regions. In Southamerica, serologic evidences of Bluetongue Virus were recorded in allcountries except Uruguay and Bolivia. Argentina and Brazil are the only two countries where thevirus was isolated. In Argentina, five Bluetongue Virus serotype 4 isolates have been obtainedfrom asymptomatic cattle. Three isolates were obtained in years 1999-2001, and two in years 2009 and 2010 as result of this thesis work. Prophylactic immunization of susceptible animals is the most practical and effectivemeasure to prevent Bluetongue disease. From beginning of XX century, attenuated and inactivatedvaccines against Bluetongue Virus have been developed, however, biosafety issues and the wellknown adverse effects lead to the development of subunit vaccines as an alternative to classicones. In this work, we performed a molecular epidemiology study of Argentinean Bluetongue Virusisolates and we also developed a subunit vaccine delivered to antigen presenting cells. The molecular epidemiology approach was based on the sequence analysis from 5 out of 10 genome segments (Segments 2, 3, 6, 7, and 10). Segments 2 and 6 analysis showed that Argentinean sequences grouped into the serotype 4 cluster and nucleotype A group, and evenmore, they grouped in a unique Argentinean cluster whit high bootstrap value. Segments 3, 7 and 10 analysis, showed that Argentinean isolates grouped into a western topotype cluster, along withsequences already classified as originated in Africa and/or Europe. Phylogenetic analysis revealedthat all Argentinean sequences formed a well supported Southamerican lineage with independent evolutionary history. The subunit vaccine development was based on the baculoviral expression of VP2 protein,the major and immunodominant component of the outer capsid, alone or fussed to a moleculenamed APCH (antigen presenting cell homing), capable to deliver peptides or molecules to antigenpresenting cells. Immunogenicity assays conducted in guinea pigs and cattle showed that bothantigens were able to induce high neutralizing antibodies titers similar to those evoked by theinactivated vaccine. Moreover, VP2 antibody titers were comparable to APCH-VP2 titers whichwere generated using a 4 times lower dose of antigen, demonstrating the ability of APCH moleculeto enhance the generation of antibodies. As part of the immune response characterization,immunoglobulin G profile and the presence of memory T cells were analyzed. IgG profile inanimals vaccinated whit APCH-VP2 showed a higher proportion of IgG1 in comparison with VP2and inactivated BTV groups. On the other hand, immunization with both candidate vaccinesshowed the generation of memory T cells specific to VP2. In addition, the capacity of therecombinant vaccine to differentiate vaccinated animal from infected ones was confirmed. Thissection represents a contribution in the development of Bluetongue Virus subunit vaccinescapable of generating an immune response comparable to inactivated vaccines but with new andadvance features.
Fil: Legisa, Danilo Mario. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.