Modulación del comportamiento biológico de líneas celulares derivadas de adenocarcinomas mamarios murinos por el sistema nervioso autónomo parasimpático

• Autores: Español, Alejandro Javier
• Año de publicación: 2004
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Sales, María Elena
• Materia: RECEPTORES COLINERGICOS MUSCARINICOS; CELULAS TUMORALES MAMARIAS; PROLIFERACION; ANGIOGENESIS; MUSCARINIC ACETYLCHOLINE RECEPTORS; MAMMARY TUMOR CELLS; ANGIOGENESIS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Existen evidencias contradictoras acerca del efecto que ejerce el sistema nervioso autónomo parasimpático sobre la progresión tumoral. Por esto investigamos el papel que desempeña la activación de los receptores colinérgicos muscarínicos (RCM) (incluidas sus vías de transducción) en líneas celulares derivadas de adenocarcinomas mamarios murinos (LM2 y LM3) en diversas etapas del crecimiento tumoral. Primeramente caracterizamos la expresión de RCM por ensayos de unión y saturación con bencilato de quinuclidinilo, un antagonista muscarínico tritiado. Observamos que las células LM3 expresan mayor número de sitios receptores que las células LM2. Las células de epitelio mamario murino normal NMuMG, no mostraron unión específica del radioligando. Ensayos de desplazamiento con diversos antagonistas muscarínicos: atropina (AT), metoctramina, 4-DAMP y pirenzepina indicaron que el subtipo M2 predomina en las células de ambas líneas tumorales. Utilizando anticuerpos específicos contra los distintos subtipos de RCM (M1-M5) en ensayos de Western blot corroboramos un orden de expresión M2³M4>M3>M1>>M5 en ambas líneas celulares. Las células NMuMG expresan escasamente los subtipos M3 y M2. El tratamiento con el agonista muscarínico carbacol (CARB) durante 15 minutos, estimula la proliferación celular en forma concentración dependiente, siendo la concentración efectiva máxima de CARB 10-7M. La preincubación con AT previno el incremento de la proliferación ejercido por CARB. El agonista no tuvo efecto sobre las células NMuMG en ninguna de las concentraciones utilizadas. En las células LM3 el CARB promueve la proliferación, por activación del receptor M3, induciendo la producción de inositol 1,4,5-trifosfato vía fosfolipasa C (PLC) y óxido nítrico vía óxido nítrico sintasa tipo 1 (NOS1). La proliferación inducida por CARB en las células LM2 necesita la activación de los receptores M2 que promueven la liberación de prostaglandina E2 (PGE2) vía ciclooxigenasa 1 y 2 (COX-1 y COX-2). Además la activación del subtipo M1 estimula la actividad de arginasa. La neoangiogénesis es esencial para el crecimiento tumoral, observamos que ambas líneas tumorales presentan un efecto proangiogénico “per se”, el cual se incrementa por el agregado de CARB. En las células LM3 la activación de los subtipos M1, M2 y M3 induce la participación de las enzimas PLC y NOS; mientras que en las células LM2 la activación de los subtipos M1 y M2 induce la participación de las enzimas COX y arginasa. Este incremento de la angiogénesis puede ser el resultado del incremento en los niveles del factor de crecimiento del endotelio vascular, que produce el tratamiento con CARB, en ambas líneas celulares. También observamos que el CARB incrementó significativamente el crecimiento tumoral “in vivo”. En las células LM3 el efecto se debe a la estimulación de receptores M3 con formación de productos de PLC y NOS1, mientras que en las células LM2 depende de la producción de PGE2 derivada de COX-2 por activación de receptores M1. El tratamiento de las células tumorales con la misma concentración del agonista, que promueve la proliferación pero por tiempos prolongados (hasta 24 hs), produce necrosis y apoptosis de las células tumorales de manera análoga al taxol, droga de elección para el tratamiento del cáncer de mama. Concluimos que la activación parasimpática puede producir efectos antagónicos en células tumorales dependiendo de la duración del estímulo. Así el tratamiento por períodos reducidos (minutos) promueve la proliferación celular, la angiogénesis y el crecimiento tumoral; mientras que el tratamiento prolongado (horas) produce un efecto citotóxico (necrosis/apoptosis) que podría ser favorable en la terapia antineoplásica.
Contradictory evidences are stated about the action of parasympathetic nervous system on tumor progression. We here characterize muscarinic acetylcholine receptors (mAchR) expression and activity in relation to tumor cells proliferation, and angiogenesis and in vivo tumor growth Saturation binding assays with tritiated quinuclidinyl benzilate ([3H]-QNB) indicated that LM3 cells express higher amounts of binding sites than LM2 cells, without exhibiting differences in their affinity constants. Normal murine mammary epithelial cells, NMuMG, didn't exhibit [3H]-QNB specific binding. Displacement assays using different muscarinic antagonists: atropine (AT), methoctramine, 4-DAMP y pirenzepine, indicated that M2 receptor subtype is predominant in both cell lines. Western blot assays, performed in LM3 and LM2 membrane enriched fraction, using specific antibodies against mAchR subtypes (M1-M5) revealed the following order of protein receptor expression: M2≥M4>M3>M1>>M5. NMuMG cells slightly express M3 and M2 receptor subtypes. LM3 and LM2 tumor cells treatment with the muscarínic agonist carbachol (CARB) during 15 minutes, stimulates cellular proliferation in a concentration dependent manner being 10-7M the maximal effective dose. The preincubation of cells with AT prevented proliferative action of CARB. NMuMG didn't respond to the agonist at any tested concentration. In LM3 cells, CARB promotes proliferation, by activating M3 receptors, inducing IP3 production via phospholipase C (PLC) and nitric oxide by neuronal nitric oxide synthase (NOS1). Proliferative action of CARB in LM2 cells needs the activation of M2 receptors that promotes prostaglandin E2 (PGE2) liberation by cyclooxygenase-1 and 2 (COX-1 and COX-2). We also demonstrated that arginase products are needed for CARB proliferative action via M1 receptor subtype activation. Neoangiogenesis is essential for tumor growth. We observed that LM3 and LM2 cells are potent angiogenic stimuli, when are inoculated into syngeneic BALB/c mice Preincubation of tumor cells with 10-7M CARB potentated angiogenic response. In LM3 cells the activation of M1, M2 and M3 receptor subtypes triggers the participation of the PLC and NOS enzymes in tumor blood vessels formation; while in LM2 cells, M1 and M2 receptors induce the participation of COX and arginase products. We have also described that CARB is able to stimulate vascular endothelial growth factor levels, that could be up regulating angiogenic response in both tumor cell lines. In addition, CARB stimulated LM3 tumor growth by activating M3 receptors and as a consequence PLC and NOS1 products formation, while the increment in LM2 tumor volume promoted by CARB is due to COX-2 derived PGE2 liberation via M1 receptor activation. Prolonged treatment of tumor cells with 10-7M CARB (24 h) induces necrosis and apoptosis comparable to taxol treatment, a well known effective antineoplastic drug for breast cancer treatment. We can conclude that mAchR activation of murine mammary tumor cells can produce opposite effects depending on the last of action. Short term treatment of tumor cells (15 minutes) promotes cellular proliferation, angiogenesis and the tumora growth; while prolonged treatment (hours) produces cytotoxic effects (necrosis/apoptosis) that could favor antineoplasic therapy
Fil: Español, Alejandro Javier. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.