Estudio de la Síntesis de flavinas en Brucella abortus como potencial blanco terapéutico contra la brucelosis

• Autores: Serer, María Inés
• Año de publicación: 2015
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Goldbaum, Fernando
• Materia: RIBOFLAVINA SINTASA; SINTESIS DE FLAVINAS; VITAMINA B2; DESARROLLO DE DROGAS; BRUCELOSIS; BRUCELLA ABORTUS; RIBOFLAVIN SYNTHASE (RS); FLAVINS SYNTHESIS; VITAMIN B2; DRUG DEVELOPMENT; BRUCELLOSIS; BRUCELLA ABORTUS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Los miembros del género Brucella son bacterias Gram-negativas intracelulares facultativas que seadaptan a la vida intracelular en una gran variedad de mamíferos. Brucella spp causan brucelosis, lazoonosis de mayor incidencia en el mundo que afecta al ganado y a humanos, y para la cual aún nose dispone de una vacuna segura y confiable. A pesar de que Brucella no presenta factores devirulencia clásicos, exhibe una gran flexibilidad metabólica la cual le permite adaptar su fisiologíaen respuesta a los distintos microambientes encontrados durante su ciclo de vida intracelular. Estaadaptación fisiológica se basa en un ágil ajuste de la expresión de distintos subconjuntos de genes,entre los que se encuentran aquellos involucrados en el metabolismo de flavinas. La riboflavina (vitamina B2) es el precursor de FMN y FAD, dos cofactores esenciales que están implicados en unaamplia variedad de procesos celulares en todos los organismos. Esta vitamina es sintetizada enmicroorganismos y plantas, pero no en humanos y animales, los cuales deben adquirirla a través desu dieta. Los dos últimos pasos de la biosíntesis de riboflavina son catalizados por las enzimas Lumazina Sintasa (LS) y Riboflavina Sintasa (RS). Debido a la ausencia de esta vía metabólica enanimales y el hecho de que las bacterias patógenas muestran una estricta dependencia de subiosíntesis de riboflavina, se ha propuesto a LS y RS como dianas potenciales para el desarrollo defármacos antimicrobianos. En este trabajo se presentan datos que sugieren una regulacióndiferencial de los genes involucrados en la biosíntesis de riboflavina en B. abortus. Asimismo, seresolvió la estructura cristalográfica de RS de B. abortus unida al producto de reacción riboflavina ya dos análogos de producto. Para complementar estos resultados, se realizaron también estudioscinéticos y de unión sobre RS; y se llevó a cabo un ensayo de high throughput screening demicroelectroforesis capilar de una biblioteca de 44.000 compuestos en colaboración con laempresa farmacéutica Novartis en Suiza. A partir de éste se identificaron diez compuestos conpotencia micromolar del cual se identificó una serie de cinco compuestos con actividad in vivocontra B. abortus en cultivo bacteriano. En conclusión, la determinación de nuevas estructuras de RS unida a ligandos, su caracterización bioquímica y el hallazgo de nuevos inhibidores con actividadcontra B. abortus in vivo representan un avance en la búsqueda de los antimicrobianos contra labrucelosis.
Brucella spp. are facultative intracellular Gram-negative bacteria, which are adapted to intracellularlife within cells of a large variety of mammals. They cause brucellosis, a zoonotic infection with thehighest incidence in the world affecting livestock and humans and for which a safe and completelyreliable vaccine is still unavailable. Although Brucella has not classical virulence factors, it exhibitshigh metabolic flexibility, which allows it to adapt its physiology in response to differentmicroenvironments found during its intracellular life cycle. This physiological adaptation is basedon a flexible adjust of the expression of different subsets of genes, among which are those involvedin the metabolism of flavins. Riboflavin (vitamin B2) is the precursor of FMN and FAD, two essentialcofactors for all organisms that are involved in a wide variety of cellular processes. This vitamin isbiosynthesized in microorganisms and plants but not in humans and animals, which must acquire itthrough their diet. The last two steps of riboflavin biosynthesis are catalyzed by Lumazine Synthase (LS) and Riboflavin Synthase (RS). Owing to the absence of this pathway in animals and the fact thatmost pathogenic bacteria show a strict dependence on riboflavin biosynthesis, it has beenproposed that these enzymes may be promising targets for the development of new antimicrobialagents for the treatment of brucellosis. In this work, we show data that suggest a differentialregulation of genes involved in the biosynthesis of riboflavin in B. abortus. Furthermore, wepresent the crystallographic structure of RS from B. abortus. In order to describe its substratebindingsites, we solved the structure of the enzyme in the presence of bound ligands, namely oneof the products of the reaction (riboflavin) and two product analogues. To complement thesefindings, we performed kinetic and binding studies on the enzyme. A newly High-throughput Screening capillary electrophoresis assay of 44.000 compounds library was developed incollaboration with Novartis in Switzerland, which identified 10 compounds with micromolarpotency. From this subset we identified a series of 5 compounds with in vivo activity against B.abortus. In conclusion, these newly determined structures, biochemical characterization of RS andfinding of novel inhibitors with activity against B. abortus represent a progress in the pursuit ofantimicrobial compounds against brucellosis.
Fil: Serer, María Inés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.