Desarrollo de tecnología para el estudio de la activación rápida de canales iónicos

• Autores: Auzmendi, Jerónimo Andrés
• Año de publicación: 2012
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Moffatt, Luciano
• Materia: CANALES IONICOS; FLIP STATE; PATCH CLAMP; APLICACIONES DE AGONISTA ULTRA-RAPIDAS; PIEZOELECTRICO; ESTADISTICA BAYESIANA; ION CHANNELS; FLIP STATE; PATCH CLAMP; ULTRA-FAST AGONIST APPLICATIONS; PIEZOELECTRIC BAYESIAN STATISTICS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Los canales iónicos son proteínas multiméricas que regulan el pasaje de iones a través de la membrana celular acoplando su funcionamiento a factores externos como el voltaje de membrana y/o presencia de ligandos específicos. Sus dinámicas de cambio de estado pueden ser descriptas cuantitativamente en términos de un proceso de Markov, aleatorio y sin memoria. Las constantes cinéticas de estos procesos pueden ser obtenidas, a partir de resultados experimentales, con la estimación de la máxima verosimilitud (EMV), empleando el algoritmo recursivo de cadenas ocultas de Markov. En el caso particular de los canales activados por ligando se han postulado estados parciales de energía intermedia (FLIP-STATE), para explicar retardos durante la activación del receptor. Para dilucidar si la existencia de estos estados es una propiedad del receptor o de cada una de las subunidades es necesario poder realizar aplicaciones de agonista aún más breves que las del estado de arte (0.2 ms). Por tal motivo en esta tesis se presenta la creación de un método que permite realizar aplicaciones discretas de agonista ultra-rápidas (20 μs), sobre una preparación de outside-out patch clamp, marcando una mejora sustancial de 10- 50 veces comparado con el estado del arte actual y a los dispositivos comerciales, respectivamente. Se analizó el rango de condiciones en el que esta técnica puede s er empleada y se realizaron modificaciones para generar aplicaciones arbitrarias del agonista maximizando la información cinética obtenida por experimento. Por último, se realizó un análisis teórico, bajo la óptica de la estadística Bayesiana, de la respuesta de canales a aplicaciones ultra-cortas de agonista. Empleando esta técnica y método de análisis puede discriminarse entre modelos que ajustan igualmente los datos experimentales.
Ion channels are multimeric proteins that regulate the passage of ions through cell membrane coupling their functioning to external factors like membrane voltage and/or the presence of specific ligands, etc. Their change of state dynamics can be quantitatively descripted in terms of a Markov’s process, random and without memory. The kinetic constants of these processes can be obtained, from experimental results, with the maximum likelihood estimation (MLE), using the recursive algorithm of hidden chains of Markov. In the particular case of ligandactivated channels there had been postulated states of intermediate energy (FLIPSTATE), to explain delays during the activation of the receptor. To elucidate whether the existence of these states is a property of the receptor or each one of the subunits it is necessary to make applications of agonist even shorter than art state (0.2 ms). Therefore in this thesis presents the creation of a method that allows discrete ultra-fast applications of agonist (20 μs), on an outside-out patch clamp preparation, marking a substantial 10-50 fold improvement compared with actual art state and commercial devices, respectively. We analyzed the range of conditions in which this technique can be used and we made modifications to generate random applications of agonist maximizing the kinetic information obtained by experiment. Finally, we made a theoretical analysis, under the viewpoint of Bayesian statistics, of the response of channels to ultra-fast applications of agonist. Using this technique and this method of analysis can discriminate between models that also fit the experimental data.
Fil: Auzmendi, Jerónimo Andrés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.