Regulación de la luteólisis funcional y estructural. Rol de la esfingosina 1-fosfato (S1P) y del sistema Notch

• Autores: Hernández, Silvia Fátima
• Año de publicación: 2012
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Tesone, Marta
• Materia: CUERPO LUTEO; LUTEOLISIS; PREÑEZ; APOPTOSIS; ESFINGOSINA 1-FOSFATO; NOTCH; CORPUS LUTEUM; LUTEOLYSIS; PREGNANCY; APOPTOSIS; SPHINGOSINE 1-PHOSPHATE; NOTCH
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El primer capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar si la administración local de S1P en el ovario de ratas preñadas bloquea efectivamente la luteólisis inducida por prostaglandina F2 alfa (PGF2α). Se utilizaron ratas preñadas en el día 19 de la gestación a las cuales se les administró en forma local S1P o su vehículo y dos horas después una dosis luteolítica de PGF2α. Los animales se sacrificaron a las 0, 4 y 36 hs de la PGF2α. Se midió la actividad de las caspasas que contribuyen a los eventos iniciales (caspasa -2, -8 y -9) y finales (caspasa-3) de la apoptosis en grupos de CLs de cada animal. Se evaluó también la expresión de las formas fosforiladas de AKT y ERK y los niveles del factor de necrosis tumoral alfa (TNF- α) mediante la técnica de ELISA. Además se estudió la muerte celular por la técnica de ME y TUNEL y la funcionalidad luteal midiendo como parámetro la progesterona (P4) luteal. La actividad de la caspasas -2, -3 y -8 aumentó significativamente a las 4 horas de la inyección de PGF2α, no así la actividad de caspasa -9. Además aumentó el número de células apoptóticas. De forma contraria la expresión de pAKT y TNF-α y el contenido de P4 luteal disminuyó considerablemente. El tratamiento con S1P pudo prevenir el incremento en la actividad de las caspasas -2, -8 y -3 inducido por PGF2α, redujo el número de células apoptóticas, restauró la funcionalidad luteal y aumentó la expresión de pAKT, pERK y TNF-α. El tratamiento con PGF2α incrementó el número de células luteales con signos avanzados de apoptosis, (por ejemplo: fragmentación nuclear, condensación de la cromatina y la presencia de cuerpos apoptóticos) a las 36 horas de la PGF2α. En cambio S1P pudo suprimir estos efectos y además aumentó la densidad vascular en los CL. Estos resultados demuestran, por primera vez, que la administración in vivo de S1P es capaz de bloquear la acción luteolítica de la PGF2α en ratas preñadas. El segundo capítulo de esta tesis se diseñó con el objetivo de estudiar la expresión y la localización celular de los receptores Notch1, Notch4 y el ligando Dll4 en CL de ratas durante la gestación y la luteólisis inducida por PGF2α. También estudiamos el contenido de P4 sérica y de proteínas luteales relacionadas a la apoptosis luego de la administración local de un inhibidor de esta vía llamado DAPT (N- [N-(3,5-difluorophenacetyl- L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester). Se detectó marca específica de los receptores NOTCH1 y 4 principalmente en las células luteales grandes y pequeñas. Además la inmunomarcación fue evidente en los núcleos de las células luteales, de forma coincidente con el hecho de que el dominio intracelular de Notch (NICD) una vez activo se transloca al núcleo. Además, se detectó marca citoplasmática difusa para DLL4 en las células luteales grandes y pequeñas, coincidiendo con el hecho de que Dll4 se somete a la degradación proteolítica después de unión al receptor. La expresión del ARNm de Notch1, Notch4 y Dll4 en CL aislados en el día 19 de preñez se redujo significativamente después de la administración de PGF2α. En forma coincidente, la PGF2α disminuyó el fragmento activo de los receptores NOTCH1 y 4, por el contrario, no se detectaron cambios significativos en los niveles proteicos del ligando DLL4. La administración intraovárica de DAPT disminuyó los niveles séricos de P4, aumentó los niveles del fragmento activo de la caspasa-3 y la relación BAX: BCL2 24 horas después del tratamiento. También se demostró que la inhibición in vitro de la síntesis de P4 en CL de ratas preñadas con aminoglutetimida (inhibidor específico de la enzima P450scc) disminuyó el contenido proteico de NOTCH1, pAKT, y pERK. Sin embargo no se observaron diferencias significativas en los niveles proteicos de NOTCH4 y el factor de transcripción HES1. Estos resultados respaldan el rol luteotrópico de la vía de señalización de Notch para promover la viabilidad celular y la esteroidogénesis luteal, y sugieren que la hormona luteolítica PGF2α puede actuar, en parte, disminuyendo la expresión de algunos miembros del sistema Notch.
The first chapter of this thesis was designed to study if local administration of the antiapoptotic agent sphingosine 1-phosphate (S1P) to pregnant rats effectively blocks the luteolytic action of prostaglandin F-2alpha (PGF2α). On day 19 of pregnancy, 2 hr before systemic PGF2α administration, rats were injected intrabursa with either S1P or vehicle and euthanized at 0, 4 and 36 hr after PGF2α injection. The activity of four caspases, which contribute to the initial (caspase-2, -8, and - 9) and final (caspase-3) events in apoptosis was measured. The expression of the phosphorylated form of AKT (pAKT), ERK (pERK) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) was analyzed by ELISA. In addition, cell death was evaluated by TUNEL technique and electronic microscopy. We also examined luteal progesterone. The activity of caspase-2, -3, and -8 was significantly greater by 4 hr after PGF2α, but not the caspase-9 activity and the number of apoptotic cells in CL was higher. In contrast, expression of pAKT and TNF-α decreased significantly. Administration of S1P suppressed these effects, decreasing caspase activities and increasing pAKT, pERK and TNF-α expression. The administration of S1P also significantly decreased the percentage of luteal apoptotic cells induced by PGF2α. PGF2α treatment increased the prevalence of luteal cells with advanced signs of apoptosis (i.e., multiple nuclear fragments, chromatin condensation, or apoptotic bodies). S1P treatment suppressed these changes and increased the blood vessel density. These results suggest for the first time that S1P blocks the luteolytic effect of the PGF2α in pregnant rats. The second chapter of this thesis was designed to investigate the expression and cell localization of NOTCH1, NOTCH4, and the delta-like ligand DLL4 in corpus luteum (CL) from rats during pregnancy and PGF2α-induced luteolysis. We also examined serum progesterone (P4) and CL proteins related to apoptosis after local administration of the Notch inhibitor N-[N-(3,5-difluorophenacetyl- L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT). Specific staining for NOTCH1 and NOTCH4 receptors was detected predominantly in large and small luteal cells. Furthermore, in line with the fact that the notch intracellular domain (NICD) is translocated to the nucleus, where it regulates gene expression, staining was evident in the nuclei of luteal cells. In addition, we detected diffuse cytoplasmic immunostaining for DLL4 in small and large luteal cells, in accordance with the fact that DLL4 undergoes proteolytic degradation after receptor binding. The mRNA expression of Notch1, Notch4, and Dll4 in CL isolated on Day 19 of pregnancy decreased significantly after administration of PGF2α. Consistent with the mRNA results, administration of PGF2α to pregnant rats on Day 19 of pregnancy decreased the protein fragment corresponding to the cleaved forms of NOTCH1/4 CL receptors. In contrast, no significant changes were detected in protein levels for the ligand DLL4. The local intrabursal administration of DAPT decreased serum P4 levels and increased luteal levels of active caspase 3 and the BAX:BCL2 ratio 24 hr after the treatment. In addition we demonstrated that in vitro treatment of pregnat rat CL with aminoglutethimide (blocker of cytochrome P450scc), decreased luteal levels of NOTCH1, pAKT and pERK. In contrast, no significant changes were detected in protein levels for the receptor NOTCH4 and the transcriptional factor HES1. These results support a luteotropic role for Notch signaling to promote luteal cell viability and steroidogenesis, and they suggest that the luteolytic hormone PGF2α may act in part by reducing the expression of some Notch system members.
Fil: Hernández, Silvia Fátima. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.