Estudio de los residuos fosforilados del receptor quinasa LePRK2 en polen de Solanum lycopersicum VF36 (tomate cultivado) y su función en las interacciones polen-pistilo

• Autores: Salem, Tamara Marcela
• Año de publicación: 2009
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Muschietti, Jorge Prometeo
• Materia: LEPRK2; MUTAGENESIS; SITIOS DE FOSFORILACION; TRANSDUCCION DE SEÑALES; LEPRK2; MUTAGENESIS; PHOSPHORYLATED SITES; SIGNAL TRANSDUCTION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El crecimiento apical del tubo polínico es un modelo muy utilizado para el estudio de células polarizadas en plantas. Previamente caracterizamos a LePRK2, un receptor quinasa específico de polen de tomate (Solanum lycopersicum). Cuando se expresa de manera transitoria LePRK2-eGFP en polen de tabaco, se observa una disminución significativa del largo del tubo polínico y un aumento del ancho del ápice del tubo, comparado con tubos eGFP. Tubos que expresan la mutación en una lisina esencial para la actividad quinasa de LePRK2, muestran la misma longitud del tubo polínico y del ancho del ápice que los tubos eGFP control. Hemos demostrado que LePRK2 estaría presente como múltiples isoformas fosforiladas tanto en membranas de polen maduro como germinado. Utilizando un análisis comparativo de secuencias y la predicción de sitios de fosforilación, identificamos dos motivos posibles de fosforilación en el dominio citoplasmático yuxtamembrana. Mutagénesis dirigida sobre estos motivos y su sobreexpresión en polen de tabaco, muestra que ambos motivos tienen efectos opuestos en la regulación del crecimiento del tubo polínico. Sustituciones a alanina en residuos del motivo I de LePRK2, S277/S279/S282, resultó en tubos polínicos más largos, mientras que la sustitución a alanina de residuos del motivo II, S304/S307/T308, resultó en tubos más cortos. En contraste, sustituciones fosfomiméticas con ácido aspártico en estos residuos, mostró resultados recíprocos: tubos más cortos con mutaciones en el motivo I y tubos más largos con mutaciones en el motivo II. Concluimos que la longitud del tubo polínico puede estar controlada a través de una regulación negativa y positiva debida a la fosforilación de los residuos del motivo I y II respectivamente. Estos resultados sugieren que LePRK2 podría tener un papel central en el crecimiento del tubo polínico a través de la regulación de su propio estado de fosforilación. Hemos realizado distintos abordajes con polen maduro de tomate con el fin de determinar por espectrometría de masa los sitios de fosforilación de LePRK2, pero hasta el momento no hemos logrado identificarlos. Por otro lado, STIL, un ligando de LePRK2 proveniente del pistilo, desfosforila LePRK2 en membranas de polen maduro en 32 PγATP. Nuestra hipótesis plantea que LePRK2 está involucrada en el control del crecimiento del tubo polínico de tomate y el mismo es regulado in vivo por el equilibrio de distintos residuos de fosforilación, a veces organizados en motivos en su dominio yuxtamembrana. Por otro lado, alguno de los residuos de LePRK2 son desfosforilados por STIL.
The tip-growing pollen tube is a useful model for studying polarized cell growth in plants. We previously characterized LePRK2, a pollen-specific receptor-like kinase from tomato (Solanum lycopersicum). When transiently overexpressed in tobacco pollen tubes, LePRK2-eGFP significantly decreased pollen tube length and increased pollen tube tip width, relative to eGFP tubes. Tubes that expressed a mutation in a lysine essential for kinase activity showed the same length and width as the eGFP control. LePRK2 might be present as multiple phosphorylated isoforms in mature and germinated pollen membranes. Using comparative sequence analysis and phosphorylation site prediction programs we identified two putative phosphorylation motifs in the cytoplasmic juxtamembrane domain. Site-directed mutagenesis in these motifs, and overexpression in tobacco pollen, showed that both motifs have opposite effects in regulating pollen tube length. Relative to LePRK2-eGFP pollen tubes, alanine substitutions in residues of motif I, S277/S279/S282, resulted in longer pollen tubes, but alanine substitutions in motif II, S304/S307/T308, resulted in shorter tubes. In contrast, phosphomimicking aspartic substitutions at these residues gave reciprocal results: shorter tubes with mutations in motif I and longer tubes with mutations in motif II. We conclude that length of pollen tubes can be negatively and positively regulated by phosphorylation of residues in motif I and II respectively. These results suggest that LePRK2 may have a central role in pollen tube growth through regulation of its own phosphorylation status. In order to discover LePRK2 phosphorylation sites in vivo, some approaches were tested with tomato mature pollen. Morover, STIL, a ligand of LePRK2 from pisitil, dephosphorylates LePRK2 in mature pollen membranes in the 32PγATP. We hypothesize that LePRK2 is involved in the control of tomato presence pollen tube growth, and this is regulated in vivo by the equilibrium of different phosphorylated residues, sometimes organized in motifs in the juxtamembrane domain. On the other hand, some residues of LePRK2 are dephosphorylated by STIL.
Fil: Salem, Tamara Marcela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.