Caracterización molecular y bioquímica de una nueva proteína quinasa de Trypanosoma cruzi - Pascuccelli, Verónica (1997)
En los organismos eucariotas, la regulación de las complejas interaccionesrequeridas para la diferenciación y proliferación, está mediada en parte porlos sistemas de fosforilación de proteínas. En Trypanosoma cruzi, se hanpodido caracterizar varias vías de transducción de señales a partir de laidentificación y caracterización de sus distintos componentes comoproteínas quinasas (PKA, PKC, Cam quinasa, CDK), adeninililciclasa (AC) yproteína G, entre otros. Dentro de la familia de las serina/treonina quinasas,recientemente ha sido identificada una nueva subfamilia de quinasas Llamadas RAC o PKB, cuya principal característica radica en la similitud deidentidad que existe a nivel de su secuencia aminoacídica con PKA y PKCpor igual. Estas proteínas han sido identificadas en células de mamíferos, Drosophila melanogaster, Caenorabhditis elegans, Dyctiostelium discoideumy Entamoeba histolytica pero no han sido aún detectadas en ningúntripanosomátido. Por lo tanto, nos hemos propuesto clonar el o los genesque codifican para esta nueva proteína quinasa en T. cruzi, para suposterior caracterización molecular y bioquímica y si es posible dilucidarsu probable rol in vivo. Como resultado, hemos clonado el gen que codificapara una proteína quinasa RAC homóloga (PKTc), cuyo tamaño es de 1287pb y codifica para una proteína de 428 aminoácidos. Esta proteína mostrótener entre un 60 y un 70% de homología con otras RAC quinasas. La PKTcrecombinante es capaz de fosforilar a la histona IIAS, y de autofosforilarse,fosforilando específicamente residuos de treonina en ambos casos. Utiliza ATP como dador de fosfatos, requiere exclusivamente Mn²+ para suactividad, su valor de pH óptimo es entre 6-8 y su temperatura óptima esde 37°C. El Km aparente para el ATP resultó ser de 1.6 μM. La presencia dediferentes activadores (Ca²+/Cam) o inhibidores (PKI, H7, GF, staurosporina)no mostró tener un efecto significativo sobre su actividad. Experimentos de inmunolocalización utilizando anticuerpos contra laproteína recombinante, demostraron que la enzima se encuentra anclada enla membrana posiblemente, a través de ácido palmítico. Por otro lado, através de experimentos de Western blot pudimos establecer que la PKTcestá presente en los estadios de amastigote, epimastigote y tripomastigotemetacíclico sin mostrar un patrón de expresión diferencial, que demuestraque esta proteína sería de carácter constitutivo. Experimentos deinmunoprecipitación nos permitirán en el futuro, identificar otras proteínasque interactúan con PKTc in vivo y dilucidar así la vía de transducción deseñales en la que PKTc estaría involucrada.