Oligonucleótidos inmunomoduladores para el tratamiento de la diabetes tipo 1 : efectos y mecanismo de acción del IMT504

• Autores: Gómez Bustillo, Sofía
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Montaner, Alejandro Daniel
• Materia: DIABETES TIPO UNO; NOD; OLIGONUCLEOTIDOS; IMT504; CELULAS MADRE MESENQUIMALES; MODULACION DEL SISTEMA; NOD; OLIGONUCLEOTIDE; IMT504; MESENCHYMAL STEM CELLS; IMMUNE SYSTEM MODULATION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad autoinmune donde las células beta del páncreas son destruidas por células inmunológicas. Actualmente, no existe ninguna intervención clínica efectiva y, por ende, los pacientes deben ser tratados de por vida con insulina. De todas formas, este tratamiento no es suficiente para evitar las complicaciones a largo plazo y, además, la calidad de vida de los pacientes está limitada. Avances en inmunología y regeneración permitieron el desarrollo de nuevos tratamientos, sin embargo, su uso se vio limitado por la necesidad crónica de medicamentos inmunosupresores. Por lo tanto, nuevas estrategias son indispensables para prevenir, tratar y/o curar la DT1. En este contexto, surge el uso de oligonucleótidos (ODNs) inmunomoduladores de la familia PyNTTTTGT. El IMT504, prototipo de esta familia y conocido por sus propiedades regenerativas, ha demostrado reducir los niveles de glucemia en ratones diabéticos no obesos (NOD/LtJ). En este proyecto de tesis, evaluamos el efecto del IMT504 sobre células madre mesenquimales (MSCs) extraídas de médula ósea y células linfoides [linfocitos B (LB) y linfocitos T (LT)] extraídas del bazo, páncreas y nódulos linfáticos drenantes. MSCs y linfocitos de ratones NOD prediabéticos (pre-DT1) y diabéticos (DT1) fueron tratados in vitro con diferentes dosis de IMT504 (entre 0,5 y 20 μg/ml). Además, realizamos ensayos de viabilidad, proliferación y migración en MSCs. Determinamos que dosis bajas del IMT504 estimulan la formación de unidades formadoras de colonias [CFU-F (106 células sembradas/cm2 ): IMT504: 85 vs Control: 65 p<0.05] e inducen la capacidad migratoria (índice migratorio: IMT504: 75 vs Control: 20, p<0.05). El efecto inductor fue detectado con la dosis de 0,5 μg/ml, mientras que dosis mayores a 10,5 μg/ml no generaron diferencias o incluso lograron el efecto contrario. Asimismo, no obtuvimos diferencias significativas en la activación y proliferación de LB de bazo luego del tratamiento con dosis altas de IMT504. Respecto a los LT, utilizamos células aisladas de páncreas o nódulos linfáticos. La población de interés se separó por citometría de flujo y se estimuló in vitro con 0,5 μg/ml de IMT504 o de ODN control. Luego de la estimulación, se midió la actividad y funcionalidad de los linfocitos (inducción de células T reguladoras y expresión de genes por citometría y activación de vías de señalización por qPCR). El IMT504 indujo la producción de TGF-β (p < 0.05 vs control), citoquina que estimula propiedades regenerativas en células madre y en las células β pancreáticas. Además, analizamos las vías de señalización moleculares involucradas en la desregulación de la DT1. Observamos una reducción en los niveles de PI3K (p < 0.01 vs control), mTOR (p < 0.05 vs control) y STAT (p < 0.01 vs control). La disminución en la expresión de estos genes está relacionada con altos niveles del transportador de glucosa 1 (GLUT1), la normoglucemia y la reprogramación celular hacia células tipo β, respectivamente. También observamos que la expresión de MAP3K7, asociada con la destrucción de células β, disminuye (p < 0.05 vs control). En conclusión, nuestros resultados indican que el IMT054 ejerce un efecto sobre las MSCs, que podrían ser partícipes de la regeneración observada y, sobre los LT, de forma de apagar o disminuir la respuesta auto inflamatoria que lleva al establecimiento y desarrollo de la DT1.
Type 1 diabetes (T1D) is a multifactorial autoimmune disease where autoreactive T cells destroy insulin-producing pancreatic β-cells. Currently, there are no effective clinical interventions for T1D, and patients rely on insulin treatment for life. There is a consensus that new innovative approaches to predict, treat, and prevent T1D. Different strategies to modulate the immunological response and restore β-cell mass have been performed but are limited by the availability of grafts and the need for chronic immunosuppression. IMT504 is the prototype of the PyNTTTTGT family of immunomodulatory oligonucleotides (ODNs), which are known for their regenerative properties and have been shown to be effective in lowering glycemia in nonobese diabetic (NOD/LtJ or simply NOD) mice. Here, we investigate the effect of IMT504 on bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) and splenocytes in NOD/LtJ mice. BM-MSCs and splenocytes from pre-diabetic and diabetic NOD mice were treated in vitro with different doses of IMT504 (from 0.5 to 20 μg/ml). Fibroblast colony-forming units (CFU-F) that originate MSCs, viability, and migration assays were assessed. It was determined that 0.5 μg/ml of IMT504 stimulated MSCs (CFU-F (106 seed cells/cm2): IMT504: 85 vs. Control: 65, p<0.05) and migration capacity (migration index: IMT504: 75 vs. Control: 20, p<0.05). No differences were observed in splenocyte activation/proliferation at higher doses. Also, we investigate the effect of the ODN IMT504 on T cells from NOD mice. Infiltrating T cells were isolated from the pancreas and lymph nodes of pre-diabetic and diabetic NOD mice. Cells were then sorted and treated in vitro with 0.5 μg/ml IMT504 or control ODN. After treatment, lymphocyte activity and functionality were characterized (differentiated T cell subsets, gene expression (cytometry), activated signaling pathways (qPCR), and induction of regulatory T cells (cytometry)). IMT504 induced TGF-β (*p < 0.05 vs. control), a cytokine that stimulates regenerative properties in stem cells and higher β-cell number. We analyzed the molecular signaling pathways involved in the deregulation of T1D. We measured lower levels of PI3K (*p < 0.01 vs. control), mTOR (*p < 0.05 vs. control), and STAT (*p < 0.01 vs. control). Downregulation of these genes is associated with higher levels of glucose transporter 1 (GLUT1), normalized glycemia, and cellular reprogramming into β-like cells, respectively. MAP3K7 expression, which is associated with β cell destruction, was also downregulated (*p < 0.05 vs. control). In conclusion, our results indicate that IMT504 exerts an effect on MSCs and T cells that may prevent the onset of diabetic autoimmunity.
Fil: Gómez Bustillo, Sofía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.