Caracterización y modulación del reciclado vesicular en placa neuromuscular de ratón

• Autores: Perissinotti, Paula Patricia
• Año de publicación: 2010
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Uchitel, Osvaldo Daniel
• Materia: LEVATOR AURIS LONGUS; PLACA NEUROMUSCULAR; INDICADORES FLUORESCENTES TIPO FM; RECICLADO VESICULAS; ENDOCITOSIS; EXOCITOSIS; CANALES DE CALCIO DEPENDIENTES DE VOLTAJE; NEUROMODULADOR; ADENOSINA; LEVATOR AURIS LONGUS; NEUROMUSCULAR JUNCTION; FM FLUORESCENT DYE; VESICLE RECYCLING; ENDOCYTOSIS; EXOCYTOSIS; VOLTAGE DEPENDENT CALCIUM CHANNELS; NEUROMODULATOR; ADENOSINE
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El proceso de reciclado de las vesículas sinápticas es una característica integral de la función presináptica y determina su habilidad para mantener la liberación del neurotransmisor durante una actividad repetitiva. En esta tesis, caracterizamos el reciclado de las vesículas sinápticas en el terminal neuromuscular de ratón y estudiamos su regulación por los canales de calcio dependiente de voltaje (CCDV), específicamente el canal de calcio tipo L, y por el neuromodulador adenosina. Para desarrollar este trabajo, utilizamos indicadores fluorescentes tipo FM para marcar la membrana de las vesículas sinápticas y técnicas electrofisiológicas para cuantificar la liberación de las vesículas sinápticas. En el terminal neuromuscular de ratón, determinamos que el reciclado vesicular es regulado por el nivel de actividad neuronal. La estimulación a alta frecuencia produce la movilización de dos pooles funcionales de vesículas sinápticas que difieren en su disponibilidad de liberación. En base a esta característica, definimos estos pooles como pooles vesiculares de liberación rápida o lenta. Por otro lado, evidenciamos que la duración de la estimulación a alta frecuencia determina un reciclado vesicular selectivo y secuencial hacia estos pooles vesiculares funcionales. El influjo de calcio a través de los CCDV tiene un papel clave en la señalización neuronal durante el proceso de la neurotransmisión, coordinando el reciclado de las vesículas sinápticas. En este trabajo presentamos evidencias directas que vinculan al CCDV tipo L con la regulación del reciclado vesicular. Hemos confirmado la funcionalidad de CCDV tipo L durante estadios plásticos del terminal neuromuscular. Es decir, observamos la participación de estos canales únicamente durante períodos de actividad neuronal sostenida e intensa. Se demostró que el influjo de calcio a través del CCDV tipo L promueve la endocitosis y la recuperación de las vesículas sinápticas hacia el pool vesicular de liberación rápida, regulando la eficiencia sináptica durante la actividad neuronal intensa. La adenosina es un neuromodulador bien establecido en la unión neuromuscular de ratón. En ausencia del efecto de la adenosina endógena sobre los receptores A1, evidenciamos un incremento en la exocitosis vesicular y en el tamaño del pool de reciclado vesicular, y un direccionamiento de reciclado vesicular hacia el pool de liberación rápida. Debido a que la adenosina y el bloqueo del CCDV tipo L presentaron un efecto similar sobre el reciclado vesicular, una hipótesis plausible fue que la adenosina a través de un efecto inhibitorio sobre el CCDV tipo L afectaría el reciclado vesicular. A través de evidencias experimentales esta hipótesis fue rechazada. En base a las similitudes observadas en el reciclado vesicular, es factible suponer que tanto la adenosina como el bloqueante del CCDV tipo L inhiben un mecanismo común.
The recycling of synaptic vesicles is an integral property of presynaptic function and it determines its ability to sustain neurotransmitter release during repetitive activity. In this thesis, we characterized vesicular recycling at mouse neuromuscular terminal and studied its regulation by voltage dependent calcium channels (VDCC), in particular the L-type calcium channel, and by the neuromodulator adenosine. We used FM fluorescent dyes in order to label synaptic vesicle membrane and electrophysiological techniques to quantify vesicle release. We found that vesicle recycling at mouse neuromuscular terminal is regulated by the level of neuronal activity. High frequency stimulation mobilizes two functional synaptic vesicle pools that differ in their release availabilities. Based on this characteristic, we defined these pools as the fast release pool and the slow release pool. On the other hand, we found that the duration of the high frequency stimulation produces selective and sequential vesicle recycling to these functional vesicle pools. Calcium influx through VDCC plays a key role in neuronal signaling during neurotransmission since it coordinates vesicle recycling. In this thesis, we show direct evidence that relate the L-type VDCC to vesicle recycling regulation. We have confirmed the L-type VDCC functionality during the plastic phase of the neuromuscular terminal. In other words, these channels participate only during intense and sustained neuronal activity. We demonstrate that calcium influx through L-type VDCC promotes endocytosis and vesicle retrieval towards the fast release vesicle pool, regulating synaptic efficiency during intense neuronal activity. Adenosine is a well known neuromodulator at the mouse neuromuscular junction. In the absence of the effect of endogenous adenosine on A1 receptors, we found an increase of the amount of vesicle exocytosis and the size of the vesicle recycling pool. In addition, we found out that vesicles are preferentially recycled under this condition to the fast release pool. Since both the addition of adenosine and an L-type VDCC blocker give rise to a similar effect on vesicle recycling, we hypothesized that adenosine produce an inhibitory effect on the L-type VDCC, affecting vesicle recycling. However, our experimental evidence allows rejecting this hypothesis and suggests that both adenosine and the L-type VDCC blocker inhibit the same mechanism.
Fil: Perissinotti, Paula Patricia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.