De la bioinformática traslacional a la bioquímica personalizada : Identificación y análisis del efecto fenotípico de variantes genéticas aplicado a la deficiencia de hormonas hipof...

• Autores: Vishnopolska, Sebastián Alexis
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Martí, Marcelo Adrián; Pérez Millán, María Inés
• Materia: BIOINFORMATICA; GENETICA HUMANA; HIPOFISIS; DESARROLLO; MOLECULAR INVERSION PROBES; PANEL DE GENES; EXOMA; GENOMA; DEFICIENCIA HORMONAL; MASSIVE ALLELE VARIANT EFFECTS; BIOINFORMATICS; HUMAN GENETICS; PITUITARY; DEVELOPMENT; MOLECULAR INVERSION PROBES; GENE PANEL; EXOME; GENOME; HORMONE DEFICIENCY; MASSIVE ALLELE VARIANT EFFECTS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La deficiencia de hormonas hipofisarias o hipopituitarismo congénito (HC) suele presentarse con fenotipos altamente variables y usualmente se ve asociada a otros defectos congénitos. Numerosos genes han sido descritos en la etiología de HC, sin embargo, se estima que solo el 16% de los pacientes recibe un diagnóstico genético certero, dejando a la mayoría de los casos familiares y esporádicos inconclusos. En este trabajo de tesis implementamos un panel de testeo de genes, utilizando secuenciación de single-molecule molecular inversión probes. Este panel consta de un conjunto de 104 genes, los cuales incluyen genes previamente reportados y genes candidatos a causar HC. Capturamos ADN genómico de 265 pacientes argentinos pediátricos con HC, ya sea aislado o con otras anomalías. Encontramos variantes candidatas patogénicas, posiblemente patogénicas y de significado incierto (VUS) en el 56% de los casos. Con el fin de validar los efectos de variantes VUS en los genes ya descritos como causantes de la patología, LHX3, LHX4, y GLI2, realizamos ensayos funcionales in-vitro, utilizando líneas celulares humanas. Para evaluar las variantes en LHX3/4 se co-transfectaron células HEK293T con plásmidos de expresión conteniendo los cDNAs de LHX3/4 wild type (WT) ó mutados, junto con plásmidos reporteros. Estos últimos, contienen el gen de la luciferasa río abajo de los promotores de ɑGSU ó GH-1, para LHX3 y 4, respectivamente. Para el análisis funcional de GLI2 utilizamos la línea celular NIH/3T3-CG, la cual fue transfectada establemente para expresar GFP ante la presencia de la forma activa de GLI2. El gen Gli2 endógeno fue knockeado por CRISPR-Cas9. Utilizamos entonces esta nueva línea reportera para evaluar la capacidad de GLI2 WT ó mutado de restaurar la expresión de GFP. Mediante estos distintos experimentos funcionales, concluímos que las variantes LHX3:p.Pro187Ser LHX4:p.Arg84His, p.Gln100His y p.Trp204Leu y GLI2:p.Ser1404Lfs afectan a la activación del gen reportero, mientras que las variantes LHX3:p.Leu220Met, GLI2:p.Ala203Thr y p.Leu761Pro tiene actividad equivalente a las proteínas WT en sus respectivos ensayos. Por otro lado, evaluamos una variante sinónima en POU1F1 y una variante intrónica en PNPLA6, ambas identificadas por secuenciación completa de exoma y genoma respectivamente y predichas como disruptores del splicing. Análisis del ARN de los pacientes confirmaron que ambas variantes afectan la longitud del ARN mensajero, probablemente afectando la función de la proteína o su presencia. Por último, proponemos la creación de un catálogo funcional para variantes en los genes POU1F1 y GLI2. Para ello, construímos todas las posibles variantes de nucleótido único en el exón 2 de POU1F1, región involucrada en splicing, por mutagénesis de saturación. Luego de transfectar células COS7 con los plásmidos conteniendo todas las variantes, se secuenció el ARN transcripto y se evaluó la proporción de las distintas isoformas de POU1F1 ó la pérdida completa del exón. Asimismo, desarrollamos los primeros pasos para evaluar de manera equivalente múltiples variantes en el dominio de transactivación de GLI2. Creemos que el análisis funcional de variantes potencialmente patogénicas se vuelve crítico a la hora de definir un diagnóstico molecular preciso. En este trabajo queda plasmada esta necesidad, y se muestra que la identificación de variantes causantes de HC es una tarea complicada debido a la variación fenotípica y penetrancia incompleta. Se debe seguir trabajando en la creación de un catálogo entero de efectos de variantes en genes causantes de la patología, disponible para los/as médicos/as, de forma de simplificar la interpretación de variantes nóveles encontradas y reducir así la odisea de diagnóstico.
Congenital hypopituitarism (CH) presents with highly variable phenotypes and is often associated with other birth defects. Several genes have been described in CH etiology, however only an estimated 16% of patients receive a genetic diagnosis, thus the majority of familial and sporadic cases have unknown genetic origin. We implemented a target panel genetic screening using single-molecule molecular inversion probes sequencing to identify causative mutations in a set of 104 previously reported and candidate associated genes. We captured genomic DNA from 265 argentinean pediatric patients with CH, either alone or with other abnormalities. We found candidate pathogenic, likely pathogenic and uncertain significance variants (VUS) in 56% of the cases. In order to validate the effects of VUS in known causative genes LHX3, LHX4, and GLI2, we performed in-vitro functional assays to study the activity of the mutated proteins. To test LHX3/4 variants we co-transfected HEK293T cells with wild type (WT) or mutated LHX3/4 variant plasmids and the luciferase reporter gene downstream of ɑGSU promoter or GH1 promoter respectively, and the luciferase assay was performed. For GLI2 functional analysis, we used the cell line NIH/3T3-CG, which was stably transfected to express GFP under the presence of GLI2 activated form. Endogenous Gli2 was knocked out by CRISPR-Cas9 and clones were selected for absence of GFP expression upon activation of the sonic hedgehog pathway. We tested the ability of transfected WT or mutated GLI2 expression plasmids to restore GFP fluorescence. We concluded that variants LHX3:p.Pro187Ser LHX4:p.Arg84His, p.Gln100His and p.Trp204Leu and GLI2:p.1404Lfs impair activation of the reporter gene, while the LHX3:p.Leu220Met and GLI2:p.L761P have WT activity on their respective assays. We also tested a synonymous variant in POU1F1 and an intronic variant in PNPLA6, both found in whole exome and whole genome sequencing respectively, that splicing predictors assessed as splicing disruptive. Minigen experiments confirmed that both variants affect the length of the resulting ARN, possibly affecting protein function or availability. Finally, we proposed to create a catalog of functional testing of variants for POU1F1 and GLI2. We created all possible SNV in exon 2 of POU1F1 by saturation mutagenesis in a minigen plasmid, transfected cells and then extracted and sequenced ARN transcribed from the plasmid. That allowed us to test whether each variant affected the proportion of alpha, beta isoforms of POU1F1, or promoted exon skipping. Finally, we developed the first steps to test in a similar fashion multiple variants of GLI2. Identification of disease causing variants in CH is complicated by phenotypic variation and incomplete penetrance. Functional testing of potential pathogenic variants becomes critical to arrive at a definitive molecular diagnosis. Further work needs to be done to have a full catalog of variant effects in known causative genes available to clinicians in order to simplify the interpretation of novel found variants and reduce diagnostic odyssey.
Fil: Vishnopolska, Sebastián Alexis. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.