Desarrollo de caña de azúcar transgénica resistente al Sugarcane mosaic virus (SCMV) y al Sorghum mosaic virus (SrMV) por silenciamiento génico

• Autores: Gómez, Maximiliano
• Año de publicación: 2012
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Vas, Mariana del; Serino, Germán
• Materia: DIVERSIDAD GENETICA DEL MOSAICO; MUESTREO VIRAL A GRAN ESCALA; TRANSFORMACION DE PLANTAS; PTGS; ENSAYO EN INVERNACULO Y A CAMPO; LARGE SCALE VIRAL SAMPLING; MOSAIC GENETIC DIVERSITY; COAT PROTEIN; PLANT TRANSFORMATION; PTGS; GREENHOUSE AND FIELD PERFORMANCE
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El desarrollo de plantas transgénicas que explotan el mecanismo desilenciamiento génico contra los virus causales del mosaico (SCMV y SrMV) representauna interesante estrategia alternativa a los métodos de mejoramiento genético clásico. Sin embargo hasta el momento dichas estrategias han sido implementadas en base alconocimiento de unas pocas secuencias virales, lo que incrementa la posibilidad de quela resistencia sea quebrada por variantes poco frecuentes del virus. Se desarrolló unprotocolo simple, rápido y económico diseñado para obtener secuencias virales a partirde un gran número de hojas de caña sintomáticas. Utilizando dicho protocolo se analizóla estructura poblacional de los virus causales del mosaico de la caña de azúcar en la Argentina y las áreas cañeras limítrofes de Bolivia, Uruguay y Paraguay, incluyendo 103 sitios de muestreo. Se analizaron 567 muestras sintomáticas por RT-PCR (pertenecientes a 104 genotipos de caña de azúcar) amplificando un fragmento del gende la proteína de cápside del SCMV y del SrMV con iniciadores reportados en laliteratura. Los productos de amplificación fueron secuenciados directamente. El análisisde las secuencias virales determinó que el principal agente causal de mosaico en laregión es el SCMV, presente en 94% de las muestras. El SrMV estaba presente en solo 2,8% de las muestras, con bajos porcentajes de coinfección de los dos virus (0,5%). Lassecuencias fueron analizadas filogenéticamente y clasificadas en cuatro grupos viralesutilizando un valor de corte de 0,91 de identidad de secuencia, con un nuevo grupo viral (W) propuesto dentro de la clasificación del SCMV reportada en la literatura. Se diseñóun transgén de resistencia para desencadenar el silenciamiento génico contra todas lasvariantes virales encontradas en el muestreo realizado. Se seleccionaron tres fragmentosdel genoma viral evolutivamente conservados: parte del gen P3 (función probables deanclaje a membrana del complejo de replicación) y dos fragmentos no homólogos delgen de la proteína de cápside, para ser clonados en direcciones opuestas a ambos ladosde un intrón (construcción tipo horquilla), bajo la dirección del promotor del gen de laubiquitina de maíz. Se obtuvieron plantas transgénicas de cinco variedades de caña deazúcar de interés comercial y fueron desafiadas con el SCMV en un ensayo de inoculación artificial en invernáculo y en un ensayo a campo bajo condiciones naturalesde infección en la Chacra Experimental (provincia de Salta). Resultados preliminaresindican la ocurrencia de eventos resistentes a la infección con mosaico de cuatrovariedades de caña. El análisis molecular de un grupo de eventos es consistente con unaresistencia mediada por silenciamiento génico. Se planea la realización de ensayos acampo para confirmar el fenotipo de resistencia a mosaico e identificar eventos queconserven las características agronómicas del genotipo transformado.
Attractive alternatives to traditional resistance breeding in sugarcane against sugarcaneand sorghum mosaic virus (SCMV and SrMV, respectively), both causal agents ofmosaic disease, have derived from transgenic approaches exploiting gene silencing. Such approaches, however, have been implemented based upon relatively few availablevirus sequences, therefore it is possible that infrequent variants escape gene silencingand break resistance. We developed a simple, fast and economic protocol designed toobtain viral sequences from a large set of symptomatic sugarcane leaf samples. Usingthis protocol, we estimated the population structure of potyviruses causing sugarcanemosaic disease throughout the sugarcane growing area of Argentina and neighboringregions in Bolivia, Uruguay and Paraguay by analyzing sugarcane leaf samples showingmosaic symptoms from 103 locations, including commercial and experimental fields. Aset of 567 samples from 104 sugarcane genotypes were extracted and analyzed for thepresence of a genomic fragment including most of the SCMV and SrMV coat proteincoding regions by RT-PCR using reported sets of primers. PCR products were directlysequenced using the same amplification primers. Sequence analysis demonstrated that SCMV is the predominant mosaic virus infecting sugarcane in the region, and is presentin 94% of the samples. SrMV was present only in 2.8% of samples, with low (0.5%)coinfection rates. Sequences were subject to phylogenetic analysis and classified intofour viral groups using a 0.91 nucleotide identity cutoff, and a new group (W) wasproposed to be included in the SCMV classification previously reported. A resistancetransgene was designed to trigger silencing mediated resistance against all virus variantsfound in the large scale survey. Three viral fragments: a P3 gene fragment and two nonoverlappingfragments from the coat protein gene, were cloned in opposite directionsseparated by an intron in a hairpin construct, and placed under the maize UBI promoter. Transgenic sugarcane plants belonging to 5 varieties were obtained and putative eventswere tested in the greenhouse with artificial inoculation and in a field trial at Chacra Experimental (Salta province) under natural infection conditions. Preliminary resultsindicate the occurrence of events from four sugarcane varieties that are resistant tomosaic infection. Preliminary molecular analysis are consistent with a resistancemechanism mediated by gene silencing. Further analysis are needed to identify resistantevents that have a good agronomic performance as well.
Fil: Gómez, Maximiliano. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.