Estudio de variantes de nucleótido único presentes en el clon leucémico en pacientes con leucemia linfoblástica aguda pediátrica - Gomez Mercado, Ignacio Nahuel (2024)
La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es el cáncer con mayor incidencia en menores de 15 años y la principal causa de mortalidad en pediatría relacionada a cáncer. Si bien en los últimos años ha mejorado mucho la sobrevida de los pacientes, entre un 15-30% de los pacientes presentan recaída de la enfermedad, y los tratamientos actuales están asociados a toxicidad aguda y a largo plazo. El tratamiento actual requiere la clasificación de los pacientes en grupos de riesgo según parámetros bioquímicos, clínicos y genéticos, permitiendo ajustar el esquema terapéutico en cada grupo, tanto en intensidad como en la complementación con terapias dirigidas a blancos moleculares específicos. Tradicionalmente, los subgrupos moleculares que se identifican al diagnóstico en LLA se definen por la presencia de determinadas alteraciones cromosómicas, como genes de fusión, rearreglos cromosómicos complejos o aneuploidías. Actualmente, gracias a la aplicación de las tecnologías de secuenciación masiva en un gran número de pacientes, se han identificado más de 30 subtipos distintos de LLA, caracterizados por perfiles de expresión génica, rearreglos cromosómicos (algunos de ellos crípticos), variantes puntuales y aneuploidías. En nuestro grupo de trabajo, por primera vez en Argentina, se realizó una caracterización en profundidad del perfil molecular de las leucemias de 32 pacientes con LLA pediátrica tratados bajo el protocolo clínico nacional multicéntrico ALLIC-GATLA 2010, mediante secuenciación del transcriptoma. Este análisis permitió la identificación de subtipos moleculares, variantes de nucleótido único y transcriptos de fusión, incluyendo variantes novel cuya caracterización forma parte de este trabajo de tesis. Por otro lado, el componente inmunitario del microambiente tumoral es un factor poco explorado que podría desempeñar un papel en el establecimiento o progresión de la enfermedad, como así también modular la respuesta a quimio- e inmunoterapias. Es por esto que resulta de gran interés comprender las interacciones entre el sistema inmunitario presente en el microambiente tumoral y las células leucémicas. En nuestro grupo de trabajo hemos caracterizado dicho componente a través del análisis del transcriptoma e identificado un subgrupo de pacientes con mayor abundancia de células citotóxicas y menor sobrevida libre de eventos. En este contexto, bajo la hipótesis de que variantes genéticas presentes en el clon leucémico pueden alterar el reclutamiento y/o interacción con células del sistema inmunitario en el microambiente tumoral, en el primer objetivo específico de esta tesis se llevó a cabo una búsqueda de variantes de nucleótido único en genes de las vías de la colección Reactome asociadas con el sistema inmune, a partir de datos provenientes de la secuenciación del transcriptoma completo de muestras de aspirado de médula de 32 pacientes argentinos con LLA pediátrica al momento del diagnóstico. Se desarrolló un flujo de trabajo bioinformático para el filtrado, anotación y priorización de variantes de interés para este estudio. El análisis comparativo de muestras secuenciadas por duplicado permitió establecer un valor umbral del parámetro QUAL, obtenido a partir del llamado de variantes, para el filtrado de variantes de alta confianza, estableciendo una especificidad del 95%. Mediante esta estrategia se hallaron 11 variantes en 9 muestras, distribuidas en los genes TP53, KRAS, CEP290, UBE3B, CPNE3, DUSP4, BTN3A3, DAPP1, RNF135, TBC1D10C y TLR1. Una de las 11 variantes, presente en el gen CPNE3, resultó novel, ya que no se encontró reportada en población general ni pacientes de ninguna patología. Posteriormente, se agregó información disponible en bases de datos públicas a la caracterización de las mismas. Finalmente, se evaluó la asociación entre la presencia de las variantes en cada muestra, perfiles de expresión génica e índice citolítico como estimador de la abundancia de células citotóxicas. El segundo objetivo específico consistió en caracterizar funcionalmente variantes somáticas novel halladas previamente en nuestro grupo de investigación en muestras de LLA de pacientes argentinos. En particular se trabajó con variantes puntuales halladas en los genes CSF3R y DUX4. Para ello, se llevó a cabo la puesta a punto del clonado, mutagénesis y expresión de proteínas recombinantes, como así también una caracterización in silico de las mismas. Los resultados obtenidos en este trabajo contribuyen a la caracterización de variantes somáticas presentes en leucemias pediátricas en pacientes argentinos y al desarrollo de flujos de trabajo bioinformáticos basados en transcriptómica, que pueden ser de aplicabilidad a otros modelos de tumor. El análisis en profundidad de las variantes halladas tiene el potencial de identificar mecanismos moduladores de la interacción entre el sistema inmunitario y las células leucémicas en el contexto de la LLA.