Identificación, caracterización, mapeo y organización genómica de genes de resistencia a la roya del girasol

• Autores: Bulos, Mariano
• Año de publicación: 2019
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Heinz, Ruth Amelia
• Materia: GIRASOL; PUCCINIA HELINATHI; ROYA; MAPEO; MARCADORES MOLECULARES; ALELISMO; SUNFLOWER; PUCCINIA HELINATHI; RUST; MAPPING; MOLECULAR MARKERS; ALLELISM
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La roya más común en los girasoles cultivados y silvestres se encuentra en todos los países donde se cultiva girasol y ha causado graves pérdidas de rendimiento en Argentina, Canadá, Rusia, E.U.A. y Australia. La información obtenida a partir de monitoreos continuos de las zonas de producción de girasol con la intención de identificar las razas del patógeno presentes en las diferentes regiones y entender la dinámica producida a lo largo de los años, luego del uso de distintas metodologías de control, es una herramienta fundamental para definir las estrategias de mejoramiento. La sustitución de cultivares de polinización abierta susceptibles con híbridos que poseen resistencia a una o más razas ha disminuido considerablemente las pérdidas por roya. Sin embargo, a medida que se producen cambios en la población de roya y las razas capaces de atacar híbridos aumentan en frecuencia, las epidemias de roya se han presentado nuevamente. Existen hoy en día, numerosas fuentes de resistencia a roya identificadas en girasol, de diversos orígenes, pero solo unas pocas han sido extensivamente utilizadas, y sólo algunas de ellas han sido genéticamente caracterizadas. Además de dilucidar el control genético detrás de cada una de las fuentes de resistencia disponibles, y con el objetivo de poder hace un uso eficiente de estos genes, introgresarlos y apilarlos en germoplasma elite, es crítico conocer su ubicación genómica. Esto permitirá detectar marcadores ligados que faciliten su seguimiento a lo largo de cruzas y sus progenies derivadas. Este trabajo tuvo como objetivo general el estudio del control genético de la resistencia a roya en girasol. Se condujo un estudio de la distribución del patógeno en las regiones donde se produce el cultivo y una detallada caracterización racial. Esto permite hacer uso de los aislamientos obtenidos como una herramienta de selección y de estudio de especificidades de los factores implicados en la resistencia. Además, se trabajó para determinar la herencia de la resistencia a roya en fuentes que todavía no han sido caracterizadas genéticamente y determinar su relación con otras fuentes descriptas. Mapear en el genoma de girasol genes previamente descriptos utilizando marcadores moleculares del tipo SSR, SNP y marcadores diseñados de novo para las regiones genómicas de interés fue unos de los objetivos de mayor importancia. Al mismo tiempo, se realizó la piramidización o desagregación de genes de resistencia con el objetivo de determinar así sus especificidades. Se condujeron trabajos de recolección y análisis de aislamientos del patógeno a nivel nacional. Dichos aislamiento fueron posteriormente evaluados con materiales diferenciales, siendo algunos de los mismos seleccionados para nuestros objetivos centrales. Con el fin de entender el control genético subyacente a la resistencia se produjeron poblaciones recombinantes a partir del cruzamiento con diferentes fuentes de resistencia. Utilizando la metodología de Análisis de Segregantes en Masa se pudo establecer de manera rápida y eficiente la localización de los factores de control del carácter en el genoma del cultivo. Para dos de estas fuentes, HAR6 y P386, materiales que mostraban ser de gran utilidad para los programas de mejoramiento a nivel global dado su perfil de resistencia, se continuó con un proceso de mapeo aún más detallado. Este trabajo implicó el diseño de nuevos marcadores que permitieran mejorar la saturación en las regiones de interés, teniendo en cuenta información de secuencia previamente generada. Se realizó también un estudio de alelismo entre el factor que gobierna la resistencia en P386 y el presente en HAR4. La información obtenida permitirá la piramidización de estos factores en una misma línea endocriada de girasol. De este modo, se logró establecer un mapa de las razas fisiológicas de roya prevalentes en nuestro país y realizar comparaciones con información histórica, así como también inferir sobre los posibles motivos de los cambios observados a través del tiempo. Se pudo establecer que el control genético de la resistencia en las fuentes utilizadas estaba conferido por un gen o factor dominante, y que en todos los casos se localizaban en el grupo de ligamiento 13 del mapa público de girasol. En particular para HAR6 y P386, se mapeo de manera más detallada los factores determinantes de sus resistencias, RHAR6 y Pu6, respectivamente, y se logró establecer su posición con respecto a sus marcadores flanqueantes. Esta información permitió, además de validar una estrategia de selección asistida por marcadores para este carácter, establecer herramientas para la eliminación del arrastre por ligamiento de las regiones adyacentes. En el caso de Pu6, se logró establecer su relación alélica con R4, de HAR4. El diseño de nuevos marcadores para lograr la saturación del grupo de ligamiento 13 se llevó a cabo mediante dos estrategias. La primera, basada en el diseño de nuevos marcadores microsatélites a partir de secuencias de una BAC localizada en la región de interés. Esto dió como resultado la obtención de 3 nuevos marcadores, uno de ellos, NidGi1, logró ser ubicado en los mapas de ligamiento desarrollados. La segunda estrategia estuvo basada en el diseño de cebadores degenerados con alta similitud a regiones aminoacídicas y nucleotídicas conservadas presentes en análogos de genes de resistencia. Mediante esta estrategia se logró generar productos de amplificación que, sin embargo, no mostraron polimorfismo para el material analizado. Los resultados de este trabajo permitieron contribuir al conocimiento existente sobre la genética de la resistencia a roya. Esto permitirá el diseño de germoplasma utilizando una estrategia sostenible de control de la enfermedad. Además proporciona herramientas para la asistencia a los programas de mejoramiento en la definición de fuentes de tolerancia, estrategias de introgresión y piramidización de genes en materiales elite. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven la adopción de la genómica en las distintas etapas del mejoramiento de girasol.
The most common rust in cultivated and wild sunflowers is present in all countries where this oil crop is grown and has caused severe yield losses in Argentina, Canada, Russia, USA and Australia. The information obtained from continuous monitoring of sunflower production areas with the aim of identifying rust races present in different regions and the understanding of the shifts produced over the years, after the utilization of several control methodologies, is a fundamental tool to define improvement strategies. The substitution of susceptible open pollination varieties with hybrids having resistance to one or more races has reduced the yield losses produced by rust attacks in an effective way. However, as there exist shifts in the rust populations and the races having virulence to the existing resistance genes increment their frequencies, rust breakouts were observed again. Up today, there exist several rust resistance sources developed from different origins, however only few of them were extensively deployed and only a few of them were genetically characterized. In addition to the elucidation of the genetic control in each one of the available resistance sources, and with the aim of have an efficient use of these genes, to introgress and piramidized them into elite germplasm, it is a critical to known their genomic position. This knowledge will allow the development of linked molecularmarkers in order to track those genetic factors in different crosses and through their derived progenies. The general objective of this work is to understand the genetic control behind the rust resistance in sunflower. The characterization of the pathogen distribution in the sunflower production areas and their race distribution was determined. The collection of isolates will permits the generation of tools for germplasm selection and the differentiation of the genetic factors involved in the different rust resistance phenotypes under analysis. Additionally, this work covered the genetic governance elucidation in the selected resistance sources and its relationship with other previously characterized ones. The localization of already descripted sunflower genes using molecular markers like SSRs, SNPs or de novo designed ones, based on the sequence of targeted genomic regions was one of the most important goals of this work. At the same time, the piramidization or separation of the linked resistance genes by recombination to understand their specificities was done. Isolates of the pathogen were obtained through the country. Those isolates were analyzed and characterized using a set of reference lines, and some of them were selected for further use in our work. Several recombinant sunflower populations obtained from different rust resistance sources were developed. In order to unravel the genetic control behind the resistance in each population a Bulk Segregant Analysis methodology was applied. This approach let us establish in an efficient way the localization of the genetic factors involved in the control of the resistance. A detailed mapping process was carried out in HAR6 and P386, two lines showing potential for global deployment in sunflower breeding programs because of their resistance pattern. This work implied the design of new molecular markers, using already generated DNA sequence information, to saturate the resistance target genomic regions. An allelic study was carried out among P386 and HAR4 to understand the relationship between the factors controlling their resistance. The information obtained would allow the piramidization these factors into a single sunflower line. The results of this study led to the establishment of a rust physiological race map for Argentina, and the comparison of this result with already available historic records to infer the possible reasons of the evolution patterns observed. The genetic control behind the resistance sources was established. In all the cases, the resistance was conferred by a single dominant gene or genetic factor, which was located in LG 13 of the public consensus sunflower map. In particular, the genetic factors present in HAR6 and P386, RHAR6 and Pu6 respectively, were precisely located between two highly linked markers. The information generated permit us to, in addition to validate marker assisted selection strategy for these traits, develop tools for linkage drag elimination during their introgression. Additionally, it was possible to determine the allelic relationship between Pu6 and R4, the genetic factor controlling the resistance in HAR4. The design of new markers to increase the resolution of the recombination map of LG13, was done following two different strategies. The first one, based on the development of new microsatellite markers through the analysis of the BAC sequence located on the targeted region. This yield three new molecular markers, one of these markers NidGi1, was successfully located in one of the recombination map. The second strategy, was based on the design of degenerated oligo nucleotides having high similarity with amino acidic and nucleotidic conserved regions found in resistance gene analogs. This strategy yielded amplification products that were not polymorphic among the genotypes under analysis. The results of this work contribute to the knowledge of the genetics behind the rust resistance in sunflower. This will permit the development of novel sunflower germplasm using a sustainable strategy for disease control. It will also provide tools for breeding programs in order to define sources of resistance to be used, an introgression strategy and the chance of piramidization of the responsible genes in elite material. Finally, the strategies, methodologies, tools and knowledge developed in this PhD thesis contribute to the improvement of sunflower and promote the adoption of genomics in the different stages of the sunflower breeding process.
Fil: Bulos, Mariano. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.