Heparán sulfatos : estudios estructurales y modificaciones químicas

• Autores: Kovensky, José Eduardo
• Año de publicación: 1992
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Fernández Cirelli, Alicia
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El presente trabajo tuvo por objeto el estudio de heparánsulfatos de grado de sulfatación comparables a Heparina y lamodificación química de heparán sulfatos de mucosa intestinalbovina. El conocimiento de las diferencias estructuralesentre heparán sulfato y heparina sirvieron de guia para lastransformaciones realizadas sobre heparán sulfato con el finde obtener productos de mayor actividad anticoagulante. En él se presentan: a) una descripción de la estructura y distribución de losglicosaminoglicuronanos presentes en vertebrados superiores,con especial referencia a heparán sulfato y heparina; b) una descripción de los estudios estructurales sobreheparán sulfatos, con especial referencia a los métodosdegradativos de la cadena glicosídica que brindan informaciónsobre secuencia de residuos con diferente grado y posicionesde sulfatación; c) una descripción de los estudios biosintéticos y deactividad biológica de heparán sulfato, con especialreferencia a similitudes y diferencias con heparina, el otroglucosaminoglicuronano N-sulfatado presente en la naturaleza; d) una descripción de las modificaciones químicas deglucosaminoglicuronanos y oligosacáridos relacionados, conespecial referencia al impacto del cambio de estructura en laactividad biológica; e) una descripción detallada y discusión de losresultados obtenidos: 1. Glicosaminoqlicuronanos de tejidos de rata Se aislaron dos polisacáridos altamente sulfatados (L1, PM 16.000 y L2, PM 11.700) de tejidos de hígado de rata, quefueron purificados por cromatografía en DEAE-celulosa. Se aislaron heparán sulfatos de tejidos de corazón ypulmón para comparación, que fueron fraccionados porcromatografía en geles de acuerdo a su peso molecular (C1, PM 35.500; C2, PM 15.500; C3, PM 8.300; C4, PM 4.700; C5, PM 2.800; Pl, PM 33.900; P2, PM 14.500; P3, PM 5.400). Se procedió a la extracción del heparán sulfato de hígadode rata en su forma nativa, es decir como proteoglicano, conclorhidrato de guanidinio. Después de purificar el extractopor cromatografía se aisló un único proteoglicano, a partirdel cual se liberaron L1 y L2 por tratamiento alcalino. Se determinaron las actividades anticoagulantes in Vitrousando ensayos de coagulación (anti factor IIa, anti factor Xa, APTT), que resultaron acotadas a un rango estrecho (5 a 44 UI/mg) a pesar de la amplia variabilidad de Peso Molecular ygrado de sulfatación. Las actividades anti Xa observadas para L1, P1 y C4 no fueron neutralizadas por adición de sulfato deprotamina. La caracterización de L1 y L2 (relaciónsulfato/disacárido 2,05 y 2,48 respectivamente) como heparánsulfatos altamente sulfatados y no como heparinas de bajaactividad anticoagulante fue realizada en base a lossiguientes estudios: i) análisis de componentes de L1 y L2: se cuantificaronurónicos (32,8 y 34,1%), hexosaminas (21,0 y 21,1%), sulfatototal (19,2 y 23,3%), hexosaminas N-sulfatadas (9,8 y 13,2%) yla relación idurónico/glucurónico (27:73 y 38:62,respectivamente).ii) degradación con ácido nitroso de L1 y L2: el perfilde N-sustitución se analizó por degradación con ácido nitrosoa pH 1,5 y los oligosacáridos resultantes se cromatografiaronen Biogel P2. Las glucosaminas N-sulfatadas y N-acetiladas en L1 y L2 están segregadas formando regiones ricas en N-sulfatoy regiones con alto contenido en N-acetilos consecutivos.iii) estudios enzimáticos: L1 y L2 no sufren degradaciónpor tratamiento con condroitinasa ABC y heparinasa.iv) comportamiento electroforético: se analizaron porelectroforesis discontinua en placa de agarosa, en acetato debario/1,3-diaminopropano, sistema que permite diferenciarcondroitín sulfato y dermatán sulfato, heparán sulfato yheparina, no distinguibles en otros sistemas; L1 y L2presentaron la misma movilidad que un heparán sulfato testigo,y distinta a la de una heparina. v) estudios de metilación: se extendió la aplicación delmétodo de metilación que utiliza butillitio en la generacióndel alcóxido, a polisacáridos sulfatados. Se procedió alestudio por este método de heparina, heparán sulfato de mucosabovina y L1. Las conclusiones más significativas son: — ausencia de glucosamina 3,6-di-O-sulfatada en L1; este residuo está presente en el oligosacárido del sitiode unión de heparina a antitrombina III y fue detectado sóloen heparina, — presencia de glucurónico 2-O-sulfatado en L1,componente inusual en glucosaminoglicuronanos y que no fuedetectado en los estudios comparativos realizados con heparinay heparán sulfato de mucosa bovina.vi) Resonancia Magnética Nuclear de 13C: se realizó elanálisis estructural de L1 por R.M.N. de 13C, registrándose enlas mismas condiciones los espectros de heparina, heparina N- y O-desulfatada y heparán sulfato de mucosa bovina para unanálisis comparativo de los mismos; en la región anomérica seobservan señales correspondientes a los C-l de glucosamina N-sulfatada y N-acetilada, idurónico 2-O-sulfatado yglucurónico; se comprueba la presencia de glucurónico 2-O-sulfatado por la señal a 103,0 ppm; se establecieron lassiguientes relaciones: N-Ac/N-Sulfato 56:44; 6-0H/6-O-sulfato 54:46.vii) actividades anticoagulantes: L1 y L2 presentaronbaja actividad en el ensayo APTT (14 y 44 UI/mg,respectivamente); en ambos casos la actividad anti Xa resultómayor que la actividad anti IIa; la actividad anti Xa de L1 nofue neutralizada totalmente por la adición de sulfato deprotamina. 2. Modificaciones químicas de heparán sulfatos Se aisló heparán sulfato de mucosa bovina porprecipitación fraccionada y por cromatografía de intercambioiónico a partir de una mezcla de subproductos de extracción deheparina; se caracterizó por electroforesis en placa deagarosa, espectro de R.M.N. de 13C, metilación con BuLi/MeI,perfil de degradación con ácido nitroso, análisis decomponentesy actividad anticoagulante. Este heparán sulfatose utilizó como material de partida para las modificacionesquímicas. Se realizaron seis modificaciones químicas diferentes quese analizaron por métodos químicos y/o espectroscópicos: i) O-sulfatación de heparán sulfato: se utilizaron trescondiciones diferentes: 1. sal de trietilamonio / N,N—dimetilformamida / trióxido de azufre-trietilamina; 2. salde piridinio / dimetilsulfóxido / trióxido deazufre-trietilamina; 3. sal de piridinio / N,N-dimetilformamida-dimetilsulfóxido (5:1) / trióxido deazufre-trietilamina. En todos los casos se observó un nivelvariable de N-desulfatación (por R.M.N. de 13C), que es menoren el método 3. La posición 6 de glucosamina resultó la másreactiva, seguida por la posición 2 de los ácidos urónicos.ii) N-desacetilación/N-sulfatación: la desacetilación sellevó a cabo por hidrazinólisis y se N-sulfató con trióxido deazufre-trietilamina en carbonato de sodio. Esta secuenciapermitió aumentar la relación N-sulfato/N-acetilo de 0,6:1 a 2:1 y la actividad anticoagulante de 8,3 a 25,6 UI/mg.iii) O-carboximetilación de HS: Las condiciones decarboximetilación (ácido monocloroacético en hidróxido desodio) no resultaron efectivas sobre el polímero tal cual. Lareducción previa de los grupos carboxilo permitió laintroducción de 1,15 grupos carboximetilo por disacárido. Elproducto se analizó por metanólisis —acetilación seguida decromatografía gas líquido — espectrometria de masas,caracterizándose 6-O-carboximetilhexosa y 6-O-carboximetilhexosamina.iv) oxidación con periodato de sodio / reducción /sulfatación: la oxidación de un 20 %de los ácidos urónicos de HS, la reducción de los grupos aldehido a alcohol y lasulfatación posterior dio un producto altamente sulfatado quepresentó una mayor actividad anticoagulante. Es importanteseñalar que este producto de cadena abierta es reconocido comosustrato por heparinasa, enzima especifica para ácido L-idurónico 2-O-sulfatado. v) preparación de un derivado fluorescente: por aminaciónreductiva con 2-aminopiridina / cianoborohidruro de sodiosobre los grupos aldehido generados en la oxidación conperiodato de heparán sulfato, se obtuvo un derivadofluorescente. El producto contiene 0,5 grupos fluorescentespor urónico oxidado. La eliminación alcalina del producto fueseguida por fluorescencia de los fragmentos obtenidos.vi) reacción con ácido acetilsalicilico: a través delcloruro del ácido se preparó un derivado de heparina de bajopeso molecular que contiene unidades de acetilsalicilicoacilando los nitrógenos de las unidades de glucosamina, segúnse desprende del análisis del espectro de carbono 13 y delperfil de degradación con ácido nitroso. El producto presentóuna actividad de 102,0 UI/mg (APTT). Este producto constituyeel primer conjugado heparina-acetilsalicilico que se prepara. f) una descripción de las técnicas experimentalesutilizadas.
Fil: Kovensky, José Eduardo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.