El Heparán Sulfato y la descondensación del núcleo espermático humano : estudio de su rol específico en dicho proceso y caracterización molecular de la interacción Heparán Sulfato-...

• Autores: Julianelli, Vanina Laura
• Año de publicación: 2012
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Calvo, Juan Carlos; Piñeiro de Calvo, Lucrecia
• Materia: HEPARAN SULFATO; ESPERMATOZOIDES; CONDENSACION DE CROMATINA
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

A diferencia de las células somáticas, el espermatozoide posee su cromatina empaquetada principalmente por protaminas en lugar de histonas. Las protaminas son proteínas pequeñas y básicas, debido a su alto contenido de residuos lisina, arginina y cisteína. Las cisteínas forman puentes disulfuro intra e intercatenarios, lo que le proporciona al núcleo espermático gran estabilidad y resistencia para poder atravesar el tracto masculino, el femenino y llegar con su ADN intacto hasta el sitio de fecundación. Una vez que el espermatozoide penetra en el ovocito, es imprescindible que se produzca la descondensación de su cromatina, es decir el desempaquetamiento del ADN para poder reemplazar las protaminas por histonas ovocitarias. La descondensación de la cromatina consiste en dos eventos, deben reducirse los puentes disulfuro (tiorreducción) y removerse las protaminas. Las moléculas involucradas en estos procesos son el glutatión reducido (GSH) y el heparán sulfato (HS) ovocitarios. Hasta el momento se consideraban eventos independientes y sucesivos: primero el GSH tiorreduce las protaminas, y luego el HS las remueve. Sin embargo, nuestros resultados indican que estos procesos podrían ser simultáneos y cooperativos. El objetivo de esta tesis fue avanzar en el estudio del mecanismo de la descondensación de la cromatina del espermatozoide humano in vitro en presencia de heparina (análogo estructural del HS) y GSH y su extrapolación al mecanismo in vivo durante la fertilización. Al coincubar espermatozoides humanos o núcleos espermáticos aislados con heparina y GSH, se produce un mayor porcentaje de descondensación de la cromatina, con respecto a la incubación en forma secuencial con los mismos agentes, independientemente del orden de los mismos. Utilizando naranja de acridina como técnica para evaluar en forma indirecta el estado de tiorreducción de los núcleos espermáticos, se observa que la heparina colabora con el GSH en la tiorreducción, durante la descondensación. Estos resultados fueron confirmados utilizando monobromobimane como método directo para evaluar tiorreducción. Los resultados aportados por esta tesis indican que la tiorreducción producida por el GSH, y la remoción de las protaminas producida por la heparina, durante la descondensación de la cromatina de espermatozoides humanos in vitro, ocurriría en forma simultánea, y no secuencial, ya que ambos factores cooperarían entre sí.
Unlike somatic cells, sperm have a highly packed chromatin due to the presence of protamines instead of histones. Protamines are small basic proteins, very rich in cysteine, lysine and arginine. Cysteine residues form disulfide bonds, both intra and interchain, rendering the sperm nucleus high stability and resistance during transit along the male and female reproductive tracts, thus enabling the spermatozoon to arrive at the fertilization site intact. Once the sperm penetrates the oocyte, chromatin decondensation must occur, implying the unpacking of DNA through the replacement of protamines by oocyte histones. Decondensation comprises two steps: disulfide bonds must be reduced (thioreduction) and protamines must be removed. The molecules involved in these steps are reduced glutathione (GSH) and heparan sulfate (HS) from the oocyte. Until now, these events were considered independent and consecutive: first GSH thioreduced protamines and, then HS removed them. Our results indicate otherwise, suggesting that both processes could be simultaneous and cooperative. The aim of this thesis was to advance in the study of the mechanism of nuclear decondensation of human sperm in vitro, using heparin (HS structural analog) and GSH and the extrapolation to the in vivo mechanism during fertilization. A higher degree of decondensation was observed upon coincubating of human sperm or isolated nuclei with heparin and GSH, compared to sequential incubation with the same agents, regardless of the order in which they were added. Use of an acridine orange staining technique as a means to indirectly evaluate the thioreduced status of sperm chromatin, revealed that heparin enhanced GSH thiol reducing activity, suggesting the existence of a cooperative effect between both reagents during decondensation. These results were confirmed by direct thiol reduced status evaluation uthrough labeling of free thiols in sperm chromatin with monobromobimane. The results presented herein indicate that protamine thiol reduction by GSH and removal of protamines by heparin during chromatin decondensation of human sperm in vitro, occur simultaneously rather than sequentially, since a cooperative effect could be observed between both decondensing agents.
Fil: Julianelli, Vanina Laura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.